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Ingeniería Biomédica de la Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Detalles de métricas

La cuantificación de una sola molécula de la fuerza y la especificidad de secuencia de las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos facilitaría el sondeo de la unión proteína-ADN. Aquí mostramos que los eventos de unión entre la ribonucleoproteína Cas9 catalíticamente inactiva y cualquier secuencia corta predefinida de ADN bicatenario se pueden identificar detectando cambios en la corriente iónica a medida que se translocan nanoestructuras de ADN lineales con códigos de barras adecuadamente diseñadas con ADN bicatenario de unión a Cas9. a través de nanoporos de estado sólido. Diseñamos nanoestructuras de ADN con códigos de barras para estudiar las relaciones entre la secuencia de ADN y la especificidad de unión al ADN, la eficiencia de unión al ADN y la tolerancia al desajuste del ADN de Cas9 a nivel de un solo nucleótido. La detección basada en nanoporos de nanoestructuras con códigos de barras de ADN puede ayudar a mejorar el diseño de ribonucleoproteínas eficientes y específicas para aplicaciones biomédicas, y podría convertirse en ensayos sensibles de detección de proteínas.

El reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos por parte de las proteínas es fundamental para la biología. Debido a la especificidad de la unión proteína-ADN, las interacciones entre estas biomoléculas forman la base de muchas herramientas de biodetección, técnicas de ingeniería biomolecular y nuevas terapias1,2. En particular, los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/dCas9 han surgido como herramientas poderosas para la expresión genética específica y el diagnóstico, y actualmente se está realizando un trabajo sustancial para mejorar la eficiencia y especificidad de CRISPR/Cas3,4. Por tanto, es esencial desarrollar ensayos simples y sensibles que analicen las interacciones entre los ácidos nucleicos y las proteínas en sus estados plegados y funcionales, para capturar su comportamiento nativo. Además, es imperativo que estas metodologías sean sensibles a las diferencias de secuencia de un solo nucleótido, lo que puede afectar dramáticamente la unión.

La detección de pulsos resistivos con nanoporos de estado sólido es un método atractivo para evaluar eventos de unión. La técnica ofrece la flexibilidad de estudiar ADN, ARN y proteínas en sus estados nativos con un único sistema de detección. La detección de nanoporos se basa en medir los cambios en la corriente iónica a medida que las moléculas pasan a través de un poro nanométrico mediante un campo eléctrico aplicado. El cambio de corriente iónica debido a un evento de translocación refleja el tamaño, la forma y la carga de la molécula5. Hay dos tipos de nanoporos: biológicos y de estado sólido. Aunque los nanoporos de proteínas de origen biológico son ideales para la secuenciación de ADN6, los nanoporos de estado sólido ofrecen control sobre el tamaño de los poros durante el proceso de fabricación, lo que permite la detección de una amplia gama de analitos.

Aunque esta versatilidad permite el análisis de una variedad de biomoléculas, la falta de especificidad en la detección también presenta un desafío para la detección multiplexada, en la que los objetivos de interés deben diferenciarse fácilmente. Para superar esta barrera, aprovechamos la nanotecnología del ADN, que permite el diseño y ensamblaje de nanoestructuras personalizadas que contienen sitios de unión específicos para proteínas de interés7.

En este artículo, fabricamos nanoporos de estado sólido tirando de capilares de cuarzo, también conocidos como nanopipetas, para usarlos como herramienta de detección general. El ADN bicatenario (ADNbc) crea una caída de corriente iónica en la señal de los nanoporos. Cuando se une un analito, como una proteína, al ADNbc, se crean picos de corriente secundarios. Al diseñar secuencias o sitios de unión específicos a lo largo de una cadena de ADN, se produce un patrón identificable. Esta huella dactilar se puede observar como una firma única de picos en la corriente iónica. El etiquetado y mapeo de secuencias de ADN nativas específicas en nanoporos se ha logrado previamente utilizando una variedad de métodos, incluidas sondas de ácido nucleico peptídico8,9, ligadura bioquímica10, factores de transcripción11 y modificación química con metiltransferasa y biotinilación12. Recientemente, se ha demostrado el uso de análisis de nanoporos para medir la unión de una variante de Cas9 catalíticamente inactiva o muerta (dCas9) al ADNds2,13. Nuestro sistema se basa en estos trabajos iniciales de prueba de concepto mediante la introducción de nanoestructuras de ADN diseñadas para el usuario. pruebas de objetivos de ADN definidas, ampliando así el espacio de aplicación de la detección de nanoporos, la nanotecnología de ADN y la detección de interacciones proteína-ADN. Aquí demostramos que, cuando se diseñan y prueban cuidadosamente, los complejos dCas9 podrían actuar como una etiqueta que permite un mapeo altamente específico del ADN para determinar cambios en un solo par de bases, lo cual es particularmente importante para el diagnóstico4,14.

La proteína dCas9 es una forma catalíticamente inactivada de la proteína asociada a CRISPR, Cas9, que se unirá, pero no cortará, una secuencia de ADNds objetivo de 20 pares de bases (pb). La ribonucleoproteína dCas9 (RNP) es un complejo ensamblado con una proteína dCas9 y un ARN guía (ARNg). El ARNg consta de dos cadenas de ARN, incluido el ARN CRISPR (ARNcr), que es complementario a la secuencia de ADNds objetivo, así como un ARNcr transactivador (ARNtracr). El sitio de unión de dCas9 al dsDNA se programa cambiando la secuencia del crRNA. El RNP se une en presencia de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) NGG y luego se hibridará con 8 a 12 nucleótidos objetivo aguas arriba del PAM, también conocida como región "semilla". Los desajustes en la región semilla impedirán que la RNP forme un complejo con el objetivo, mientras que los desajustes aguas abajo en la región "distal" actúan principalmente para reducir la vida útil de los complejos15.

Al dirigir el dCas9 a diferentes secuencias de ADNbc, se pueden crear patrones o "códigos de barras" únicos y específicos de secuencia de dCas9 unido y utilizarlos para la identificación multiplexada de ADN utilizando un nanoporo2. Sin embargo, para capturar todo el potencial de estos sistemas basados en dCas9, deben ser cuantitativos, escalables y específicos, lo que exige la detección de dCas9 para seleccionar una alta eficiencia y especificidad de unión. La unión depende en gran medida de la secuencia del ARNg; Si bien en algunos casos esta interacción es increíblemente específica, otras secuencias pueden poseer cientos de sitios fuera del objetivo, lo que limita la utilidad de estos sistemas16. Los métodos actuales para evaluar la unión de dCas9 al ADN se basan principalmente en secuenciación y modelado computacional17,18,19,20.

Los métodos computacionales son muy útiles para guiar el diseño experimental, pero están limitados debido a su sensibilidad a la fluctuación de los datos y a la insuficiencia de datos de entrenamiento21. Además, aunque se sabe que los desajustes afectan la probabilidad y la estabilidad de los eventos de unión para dCas9, es difícil crear un conjunto único de reglas generales para evaluar la tolerancia a los desajustes por varias razones21. En primer lugar, casi todas las herramientas computacionales disponibles se basan en conjuntos de datos experimentales a gran escala orientados a predecir la escisión, no la unión, y se ha demostrado que para Cas9 la relación entre la unión y la escisión es compleja18,22. Una capa adicional de complejidad surge de la evidencia de que la eficiencia de la escisión depende en gran medida de la secuencia de ARNg, y cada sonda tiene una tolerancia a desajustes intrínseco-guía (GMT) única23,24. GMT dificulta predecir la especificidad de una sonda sin probarla, lo que destaca la necesidad de una herramienta para detectar rápidamente las sondas de ensayo.

Al combinar mediciones de nanoporos de una sola molécula con nanotecnología de ADN, hemos creado un sistema que puede evaluar de manera única y precisa las interacciones de unión específicas de las sondas dCas9 y el ADNds objetivo. Mediante el diseño de nanoestructuras de ADN modeladas con códigos de barras con forma de mancuerna en un extremo de la nanoestructura, creamos un patrón de picos único que corresponde a una secuencia objetivo específica para dCas9 (ref. 7). Ampliamos la utilidad agregando salientes de ADNds diseñados, lo que nos permitió evaluar rápidamente la especificidad de unión de ARNg específica de secuencia de las sondas dCas9 a cualquier secuencia corta de ADN de interés. Además de medir la unión de dCas9 a la secuencia objetivo coincidente, el saliente de dsDNA se puede diseñar con mutaciones para probar la sensibilidad del crRNA a estas modificaciones. Mostramos que estos métodos son cuantitativos y que pueden diferenciar concentraciones variables de ADN con y sin mutaciones introducidas en la misma muestra. Este enfoque de probar los ARNg puede facilitar que el diseño de las RNP de dCas9 utilizadas para la expresión genética y las aplicaciones de diagnóstico sean más eficientes y específicas.

Anteriormente se ha demostrado que las nanoestructuras de ADN son herramientas útiles para la medición multiplexada de la unión de biomoléculas utilizando el sistema de detección de nanoporos7. La Figura 1 presenta el diseño de la nanoestructura de ADN y el sistema de detección de nanoporos y demuestra su uso para detectar la unión de un RNP dCas9 a una secuencia saliente de ADNds objetivo particular.

a, Esquema de la estructura del ADN con la región del código de barras del ADN y el saliente de dCas9. Se resaltan tanto las secuencias utilizadas para la región con forma de mancuerna que crea el código de barras (azul) como el esquema de la región de ADN objetivo que actúa como saliente (verde). Además, se muestran los componentes involucrados en el RNP dCas9. b, Nanoporo de estado sólido con dos nanoestructuras de ADN diferentes (11111 y 11001) mezcladas en solución. Ambas estructuras se muestran con y sin unión a dCas9, destacando la capacidad de determinar la especificidad y la eficiencia de unión. c, Trazas de corriente del nanoporo de las diferentes nanoestructuras de ADN cuando se añaden dos sondas. El exceso de 50 pb no se puede resolver a menos que se una el dCas9.

En la Fig. 1a mostramos un esquema de la nanoestructura del ADN. Como se describe en detalle en Métodos, las nanoestructuras de ADN se crean a partir de una columna vertebral de ADN monocatenario (ssDNA), con oligos básicos complementarios a la columna vertebral que se unen a lo largo de su longitud. Las secciones de la nanoestructura que son totalmente complementarias a la cadena principal del ssDNA aparecen en un evento de translocación como una gota de corriente correspondiente al dsDNA. Se reemplaza una sección de los oligos básicos y una porción de la nanoestructura de ADN se modela en un código de barras de ADN que consta de cinco picos que se pueden configurar en '0' o '1'. El diseño del código de barras se basa en trabajos anteriores que se optimizaron para crear picos claramente distinguibles en nanoporos con diámetros de alrededor de 15 nm (ref. 7). Si bien este diseño de código de barras nos deja solo 25 (32) secuencias que se pueden probar, ya hemos explorado los límites máximos de los códigos de barras. Podemos aumentar la densidad de las nanoestructuras y la relación señal-ruido utilizando nanoporos más pequeños con 56 bits en un único portador de ADN, lo que permite una biblioteca de 256 (>1016) moléculas25. El número de interacciones entre proteínas y ADN multiplexadas está limitado únicamente por el número de nanoporos y nuestra capacidad para ensamblar estas nanoestructuras de ADN. En la región de detección de la nanoestructura, se diseñaron dos oligos para crear un saliente de ADNbc de 50 pb de longitud. Este saliente de ADNds puede presentar cualquier secuencia de ADN de interés, incluidas secuencias diana para la unión de dCas9.

Las diferentes nanoestructuras representadas en la Fig. 1b se pueden combinar en solución y trasladarse a través del nanoporo una por una. En este esquema se muestran dos nanoestructuras con códigos de barras diferentes, 11111 y 11001, con dCas9 unido y dCas9 no unido junto con las señales generadas por las estructuras durante la translocación de nanoporos (Fig. 1c). En la Fig. 1 complementaria se puede ver un rastro de corriente sin procesar con y sin ADN/proteína. La translocación puede realizarse en cualquier dirección como se ve en la Fig. 2 complementaria. Cuando dCas9 no se une al dsDNA objetivo en la región saliente, hay la ausencia del pico adicional. La región saliente contiene solo 50 pb de ADNbc por debajo del límite de detección de nuestros nanoporos y, por lo tanto, no genera ningún pico claro en la señal. Por lo tanto, la presencia o ausencia de unión de dCas9 a la nanoestructura se puede distinguir claramente mediante un algoritmo de umbral simple alrededor de la ubicación esperada del pico.

La especificidad de base única de dCas9 le otorga una ventaja como herramienta de diagnóstico para investigar mutaciones puntuales en secuencias clínicamente relevantes. La mutación puntual única en el gen katG315 en Mycobacterium tuberculosis es responsable de la resistencia a los antibióticos a la isoniazida en el 64,2% de los casos resistentes26. La región de ADN objetivo que contiene esta mutación se seleccionó como se ve en la Fig. 2a. Antes de utilizar las RNP dCas9 como herramienta de diagnóstico, es esencial crear un método para probar la especificidad de la sonda. Esto se probó creando dos nanoestructuras diferentes con diferentes códigos de barras y diferentes salientes con regiones objetivo de ADN idénticas al genoma de tipo salvaje y al genoma resistente con la mutación.

a, las sondas dCas9 y las nanoestructuras de ADN sobresalen de los esquemas que representan la diferencia de una sola base entre las secuencias de la sonda crRNA (con el PAM en rojo) y el sobresaliente del ADN. El cambio de un solo par de bases se puede encontrar en el gen Kat315 en Mycobacterium tuberculosis resistente a la isoniazida. Se representan dos nanoestructuras de ADN diferentes con diferentes salientes (verde y morado). b, Especificidad de unión de las sondas cuando se agregan ambas nanoestructuras de ADN y solo se agrega una sonda respectiva. N > 65 eventos para cada experimento. También se probó una nanoestructura de control con ADN objetivo que no contenía PAM, como se ve en gris, donde N > 165. Los cálculos se realizaron utilizando las ecuaciones (1) y (2). c, Cuantificación de eventos marcados que dependen de la variación de la relación de concentración relativa de nanoestructuras de ADN (verde o violeta) en solución con concentraciones equimolares de las dos sondas dCas9 (la desviación estándar representa una muestra medida en al menos dos poros diferentes). Los cálculos se realizaron utilizando las ecuaciones (3-6). N > 85 eventos para cada condición. Las barras de error representan la desviación estándar entre nanoporos. d, Experimentos reproducidos con códigos de barras de nanoestructuras 11001 y 11111 en una proporción de 2:1 en solución con concentraciones equimolares de ambas sondas dCas9 agregadas. Las diferentes barras (1, 2 y 3) son tres repeticiones de preparación de muestras independientes en tres nanoporos diferentes. Los cálculos se realizaron utilizando las ecuaciones (3-6). N > 100 eventos para cada medición. En todos los experimentos, se agregaron sondas dCas9 en exceso para apuntar a las moléculas de ADN.

Agregamos una de las sondas dCas9 a la vez a concentraciones equimolares de las dos nanoestructuras de ADN como se ve en la Fig. 2a. Esto se hizo para probar la eficiencia de unión y la especificidad de cada sonda en presencia del cambio de un solo par de bases como se ve en la Fig. 2b. Descubrimos que ambas sondas dCas9 tenían una alta especificidad para su objetivo perfectamente coincidente, con más del 94,7% y el 94,0%, respectivamente, de los eventos de nanoestructuras de ADN con códigos de barras claros etiquetados correctamente. Se encontró que las nanoestructuras con una mutación que no coincidía con la sonda que se estaba probando tenían una unión del 5,3% y el 6% respectivamente. De manera similar, se encontró que un control realizado sin secuencia PAM y la sonda violeta tenía una unión del 4,2% (N = 169). Estos falsos positivos probablemente se deben a nudos en el ADN durante la translocación que pueden producir señales similares a una proteína dCas9 unida en el rastro del evento. Las ecuaciones utilizadas para calcular estos valores se pueden ver en Métodos. El número de eventos difiere entre experimentos debido al porcentaje de eventos desplegados claramente etiquetados que se utilizan en el análisis de datos después de la medición. Nuestros resultados muestran que, con sondas cuidadosamente diseñadas y probadas, podemos diferenciar la unión a objetivos de ADNbc con especificidad de un solo nucleótido.

Otra capacidad crucial de las herramientas de biodetección es la capacidad de cuantificar la abundancia relativa de secuencias objetivo. Probamos la naturaleza cuantitativa de la unión de las sondas dCas9 a su ADN objetivo mezclando cantidades equimolares de dos sondas de ARNcr y variando la proporción de las dos nanoestructuras de ADN objetivo diferentes identificables por sus respectivos códigos de barras, como se ve en la Fig. 2c. Utilizando concentraciones relativas de nanoestructuras de ADN con cada código de barras en proporciones 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 y 100:0, se encontró que la proporción de eventos con el código de barras y la firma dCas9 era consistente con la relativa. concentración agregada como se puede ver en la Fig. 2c. Por ejemplo, en estos experimentos, antes de la dilución para los experimentos con nanoporos, se mezcla un total de 3 nM de ADN con 50 nM de cada RNP formada. Por lo tanto, si se agregan 0,75 nM de nanoestructura de código de barras 10011 y 2,25 nM de nanoestructura de código de barras 11111, al agregar concentraciones equimolares de las RNP aún se encontrará que el porcentaje de eventos de nanoestructura con el código de barras 10011 y un pico de dCas9 será cercano al 25 % y el número de eventos de nanoestructura con un código de barras 11111 y un pico de dCas9 será cercano al 75%. Si uno sabe que la concentración de 10011 agregado fue de 0,75 nM, puede inferir a través de la concentración relativa que el otro código de barras sería de 2,25 nM. Estos porcentajes se normalizaron según las eficiencias de unión medidas para cada sonda, como se ve en Métodos. Medimos las muestras en al menos tres poros diferentes para tener en cuenta la variabilidad en la fabricación de los poros, como lo muestran las barras de error, con resultados consistentes independientemente del poro utilizado. La reproducibilidad se probó adicionalmente probando tres repeticiones independientes del paso de preparación de la muestra en tres poros diferentes al mezclar las estructuras en una proporción de 2:1. La desviación estándar entre las repeticiones independientes fue solo de ~6%, como se ve en la Fig. 2d. Además, al agregar varias sondas dCas9 a una muestra de ADN mixta, nuestro método se puede utilizar para cuantificar las concentraciones relativas de diferentes objetivos de ADN en solución. Esta combinación de cuantificación de concentraciones relativas de ADN en una mezcla, así como la especificidad para detectar cambios de un solo par de bases, es una prueba de concepto para un potente sensor de nanoporos para análisis de ADN multiplexado.

La capacidad de utilizar sondas CRISPR/dCas9 para medir cuantitativamente la cantidad de una secuencia de ADN determinada presente en una muestra tiene muchas implicaciones. La concentración de ADN en muestras se ha medido en nanoporos mediante métodos como el modelo de captura electroforética27 y el método de conteo controlado28,29. Sin embargo, métodos como el método de recuento controlado se basan en un control de ADN que tiene una longitud notablemente diferente a la de la muestra desconocida30. Si bien nuestro método requiere un estándar interno para la detección cuantitativa, no es necesario tener conocimientos previos del tamaño del ADN objetivo. La especificidad del método está determinada por las sondas dCas9 unidas. Se pueden utilizar marcadores de ADN o varias sondas dCas9 para crear un patrón de picos prediseñado en el ADN. Los patrones de picos identifican un marcador de ADN en una concentración conocida mezclándolo con una muestra de ADN en una concentración desconocida. La combinación permite determinar la concentración relativa del objetivo.

Comprender la especificidad objetivo de las sondas en función de la posición y el cambio de pares de bases de la mutación es esencial para diseñar sondas dCas9 tanto para ingeniería genómica como para técnicas de diagnóstico CRISPR. Esto se estudió utilizando una nanoestructura de ADN diferente con tres salientes resaltados en la Fig. 3a, b. Como se ve en la Fig. 3b, introdujimos cambios de un solo par de bases en los salientes tanto en el sitio PAM como en varias posiciones del sitio PAM para comparar el efecto tanto de la posición como de la identidad de la base. Las secuencias de estos salientes se pueden encontrar en la Tabla complementaria 4 y las secuencias de las mancuernas que generan picos se pueden ver en la Tabla complementaria 5. La unión de un único complejo dCas9 RNP (Fig. 3c) se probó frente a las diferentes nanoestructuras de ADN que no coinciden en el nanoporo. Se pueden ver eventos de ejemplo en la Fig. 3d. Luego se calculó la relación de unión normalizada para la sonda en las diferentes posiciones con las diferentes identidades de pares de bases y se representó en la Fig. 3e. Las ecuaciones utilizadas para calcular la relación de unión normalizada se pueden encontrar en Métodos. Estos cálculos se basan en la normalización del valor de unión al control (Xcontrol (10)), que fue del 33,7 % con una desviación estándar del 2,4 % como se ve en la figura complementaria 3. Por lo tanto, si se encuentra que una sonda tiene un porcentaje de unión del 33,7%, correspondería a un ratio de consolidación normalizado de 1,0. La normalización es un paso esencial porque esta menor eficiencia de unión para estos experimentos se debe a un aumento en la concentración de sal en el tampón. Con más pesas de ADN, se debe usar una concentración de sal más alta para retardar la translocación del nanoporo, como se ve en la figura complementaria 4; sin embargo, esto reduce la eficiencia de la unión, como se ve en la figura complementaria 5.

a, El RNP dCas9 utilizado para evaluar la especificidad de las mutaciones. b, Nanoestructura de control con secuencia objetivo sin mutaciones en la región saliente. c, Nanoestructura con salientes con desajustes en la región saliente del ADN objetivo. d, Esquema de la nanoestructura que muestra la unión de dCas9 al saliente y el correspondiente rastro del evento de nanoporo. El más a la izquierda representa la unión del RNP a una nanoestructura con tres salientes que son de control. El evento intermedio representa los tres voladizos no coincidentes sin que se observe unión del RNP. El extremo derecho representa la unión de dCas9 RNP a dos de las secuencias diana no coincidentes, lo que destaca la baja especificidad. e, Gráficos de barras para cada posible mutación de base de ADN diferente y posición con la relación de unión normalizada calculada mediante las ecuaciones (7-11). N > 45 eventos para cada experimento. Las barras de error son el resultado de la desviación estándar de la normalización para controlar la eficiencia del enlace.

Las mutaciones de uno, dos y tres pares de bases proximales a PAM muestran las eficiencias de unión más bajas, lo que sugiere que este sitio tiene la mayor especificidad para la unión de dCas9 para esta sonda determinada. A medida que las mutaciones se acercan a la región distal de PAM, hay un aumento constante en la unión de dCas9. Esto es consistente con los hallazgos en la literatura de que las bases proximales de PAM son más cruciales para la identificación exitosa del sitio PAM y la posterior unión por parte de dCas9 (ref. 31). Los hallazgos también concuerdan con la literatura en que las bases en la región distal PAM de dCas9 no son tan específicas para la unión de dCas931.

De acuerdo con la literatura, el ADN con desajustes con la unión relativa más alta se produce debido a que los desparejos adoptan un emparejamiento de bases "oscilante" o confórmeros similares a Watson-Crick32,33,34. El par de bases más tolerado (rG-dT, rU-dG, rA-dC y rC-dA) es el resultado de que la estructura flexible del ADN permite ligeros cambios en la posición de los nucleótidos, de ahí el nombre de "bamboleo". Nuestra investigación de los pares de bases ADN-ARN no coincidentes más prevalentes muestra que estos pares de bases oscilantes son dominantes desde el sitio PAM hasta el sitio 5. Esto sugiere que, cerca del sitio PAM, se toleran los pares incorrectos en el emparejamiento de bases debido a la estructura flexible del ADN. desalinear nucleótidos y que estos desajustes no obstaculicen el emparejamiento exitoso de bases de ADN-ARN. Sin embargo, las bases más alejadas del sitio PAM, comenzando en la posición 5, no muestran esta preferencia por la falta de coincidencia de oscilación. Esto quizás sugiera que, a medida que las mutaciones se alejan del sitio clave de "anclaje" de PAM, existen otros factores externos que contribuyen al emparejamiento de bases no coincidentes. La teoría de que el emparejamiento de bases 'oscilantes' influye en la especificidad concuerda con trabajos recientes en los que la incorporación de inosina en gRNA de dCas9 reduce la unión a secuencias de ADN afines, pero permite el emparejamiento con secuencias que llevan sustituciones únicas en posiciones superpuestas35. Además, en la literatura se ha establecido la base estructural de los efectos de oscilación en el contexto de Cas9, lo que respalda estas afirmaciones36.

La evaluación de la especificidad de un solo desajuste ha sido ampliamente investigada en la literatura con varias sondas diferentes. Si bien la mayoría de las sondas muestran consistentemente la tendencia proximal/distal de PAM y la tendencia de base oscilante, cada guía difiere de un papel a otro. Por ejemplo, en nuestro estudio, encontramos una disminución en la especificidad, en relación con la tendencia general, en la posición 8, y una especificidad notablemente aumentada en la posición 10. Investigaciones anteriores, aunque midieron la eficiencia de escisión, han demostrado que la secuencia central sensible al desajuste está en los pares de bases 4 a 7 aguas arriba del PAM37. Sin embargo, otras investigaciones no han mostrado diferencias importantes entre las posiciones 2 y 4 en cuanto a la eficiencia de escisión, pero han demostrado que hay un aumento en la sensibilidad a los desajustes en las posiciones 11 y 13 (ref. 38). Estas observaciones son consistentes con el concepto de que las sondas poseen distintos grados de GMT, que investigamos en la Fig. 4.

a, La sonda 1 y la sonda 2 se diseñaron y compararon utilizando nanoestructuras descritas en la Fig. 1. b, Comparando la eficiencia de unión de las sondas entre sí y con la eficiencia prevista de CHOPCHOP (gris) 39. N = 288 eventos para la sonda 1 y N = 558 eventos para la sonda 2. Las barras de error son la desviación estándar entre al menos cuatro mediciones diferentes en diferentes poros para cada sonda. c, Gráficos de barras de la relación de unión normalizada a la eficiencia de las sondas al objetivo. La sensibilidad a los cambios de un solo par de bases varía mucho entre las dos sondas, lo que destaca la influencia del GMT. Cada experimento tiene al menos N > 45 eventos. d, Variaciones de la sonda 2 con mutaciones en gRNA. e, Comparación entre la eficiencia prevista (gris) y la eficiencia de unión medida cuando se introducen mutaciones en el ARNg. Cada experimento tiene al menos más de N > 55 eventos. f, Gráficos de barras con relaciones de unión normalizadas que representan la dependencia de GMT de la sonda y una gran variación de unión entre sondas con mutaciones introducidas. Cada experimento tiene al menos más de N > 55 eventos.

Para resaltar la utilidad de esta herramienta de ensayo, se compararon dos sondas, representadas en la Fig. 4a. Estas sondas se seleccionaron debido a sus diferentes puntajes de predicción usando CHOPCHOP pero eficiencias de unión similares a las estructuras de ADN objetivo, como se ve en la Fig. 4b (ref. 39). A pesar de que la puntuación de eficiencia de predicción para la sonda 2 era baja, se encontró que tenía una alta eficiencia de unión. Esta brecha entre lo previsto y lo medido puede deberse a que la puntuación prevista se basa en la eficiencia de escisión en lugar de en la unión, ya que se sabe que los dos no son directamente intercambiables22. Sin embargo, debido a la falta de herramientas informáticas para predecir la unión, se utilizó CHOPCHOP, que proporciona un valor de eficiencia de escisión previsto. Debido a la eficiencia de unión similar, se postuló que las sondas pueden tener tendencias similares en la especificidad de un solo par de bases. Los primeros cuatro pares de bases del PAM se intercambiaron con bases que no eran pares de bases oscilantes, lo que sugeriría que las sondas deberían tener un mayor nivel de especificidad. Sin embargo, la sonda 2 demostró tener muy poca sensibilidad observada a mutaciones de un solo par de bases con una eficiencia de unión normalizada muy alta, como se ve en la Fig. 4c. A pesar de la alta eficacia de unión, esta falta de especificidad pone de relieve que esta sonda no sería útil como herramienta para detectar cambios de un solo par de bases en muestras clínicas. Por el contrario, la sonda 1 que se muestra en la Fig. 4c es una sonda altamente específica, lo que la haría útil como herramienta de diagnóstico. Esto demuestra la necesidad de un ensayo como el que se demostró en este trabajo para probar la especificidad de las sondas dCas9 antes de su implementación en experimentos adicionales. Debido a este interesante hallazgo, esta sonda se probó más a fondo introduciendo cambios de un solo par de bases en la secuencia de ARNg como se ve en la Fig. 4d. A pesar de eficiencias de unión previstas similares entre las cuatro sondas, como se ve en la Fig. 4e, las eficiencias de unión normalizadas que se midieron variaron considerablemente. Esto resalta las afirmaciones en la literatura de que la eficiencia de dCas9 y Cas9 RNP depende únicamente del ARNg que se utiliza, con diferentes guías que tienen diferentes GMT23,24. La introducción de discrepancias de un solo par de bases en el ADN tiene un efecto completamente diferente a la introducción de cambios de pares de bases en el ARN en la misma ubicación, como se ve en la Fig. 4f. Un solo cambio de par de bases entre guías puede dar como resultado un comportamiento y una sensibilidad completamente diferentes a los cambios de un solo par de bases. Debido a estos comportamientos que son únicos para guiar y las limitaciones actuales de las herramientas computacionales para predecir estos comportamientos, la técnica de ensayo como se demuestra en este trabajo es esencial para el diseño informado de la sonda dCas9.

En este trabajo, destacamos el potencial del uso de sondas dCas9 para la detección altamente específica de cambios de pares de bases en el ADN. Diferenciamos secuencias mixtas con especificidad de un solo par de bases y cuantificamos las concentraciones relativas de ADN utilizando sondas dCas9. Sin embargo, para utilizar sondas dCas9 para estas aplicaciones, es esencial evaluar primero la especificidad de la sonda. Por lo tanto, hemos presentado un ensayo modelo que es sensible y específico para probar sondas dCas9. Este ensayo se puede utilizar para verificar la especificidad de las sondas antes de utilizarlas en contextos de diagnóstico y edición de genes.

Aunque actualmente este sistema se limita a la detección de la unión de dCas9, también existe la posibilidad de que la traducción sea una herramienta para medir la escisión. Se ha demostrado que SpCas9 permanece unido de forma muy estable al ADN después de la escisión40. De manera similar, Cas12a escinde la región distal de PAM del objetivo, pero permanece unida en la región de PAM proximal41. Existe potencial para innovar en diseños de nanoestructuras de ADN similares al que se analiza en este trabajo y probar cómo la escisión de una variedad de enzimas diferentes puede verse afectada por desajustes en el ADN objetivo.

Más allá de probar la especificidad, ilustramos la utilidad de estas sondas en el ámbito del diagnóstico como método para determinar la concentración relativa. Las mediciones de concentración son particularmente importantes en enfermedades o dolencias. La abundancia relativa de una determinada bacteria o virus es relevante para determinar el tratamiento o para justificar un cambio de tratamiento, por ejemplo debido al aumento de concentraciones de un marcador de resistencia. Como hemos demostrado aquí, un beneficio adicional de las sondas dCas9 es que potencialmente pueden usarse para detectar concentraciones relativas de un patógeno con una mutación específica.

Nuestra metodología tiene el potencial de traducirse a aplicaciones más allá de las mostradas en este trabajo tanto en diagnóstico como en edición de genes. Con un conjunto ampliado de códigos de barras, se puede utilizar como un enfoque altamente específico y de alto rendimiento para analizar las RNP de dCas9 para probar cientos de ARNg en la misma medición. Si bien existen técnicas de alto rendimiento in vitro y basadas en células, como la inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación42, puede resultar excesiva dependiendo de la aplicación final. Una ventaja del sistema de nanoporos es que se pueden probar algunas secuencias de interés con cantidades mínimas de muestra (concentraciones de fM por experimento), lo que puede ahorrar tiempo y recursos al usuario. Una reducción de las cantidades de enzimas, así como de las muestras objetivo, es especialmente relevante en casos de uso de diagnóstico1,43 y en investigaciones de inhibición de dCas944, donde el ensayo de cambio de movilidad de electroforesis es el estándar de facto. En términos de desarrollo de diagnósticos, ya se ha demostrado el uso de dCas9 como etiqueta en el ADN nativo2, y mediante el uso del sistema de nanoporos de ADN-nanoestructura se pueden diseñar y probar de manera eficiente sondas dCas9.

La combinación de detección de nanoporos y técnicas de ingeniería molecular CRISPR/Cas permite un enfoque altamente específico de una sola molécula para evaluar la eficiencia de unión y la especificidad de las sondas CRISPR/dCas9. Con este fin, hemos creado nanoestructuras de ADN que contienen un saliente de ADN que puede diseñarse para tener diferentes sitios de unión de dCas9, con diferentes "códigos de barras" que identifican la secuencia saliente para permitir mediciones multiplexadas. Hemos demostrado que este sistema se puede utilizar para evaluar la especificidad de las sondas dCas9 y la intolerancia al desajuste intrínseco de la guía de diferentes sondas. Esto es particularmente importante cuando se utilizan estas sondas en aplicaciones de diagnóstico para la detección de cambios de un solo par de bases. Comparado con las técnicas tradicionales, evaluar la vinculación con este sistema proporciona ventajas en velocidad y especificidad.

Para observar que el sistema CRISPR-dCas9 es lo suficientemente específico como para detectar el par de bases único, se crearon construcciones de ADN con diferentes "códigos de barras" más una secuencia saliente para dCas9. La construcción de ADN se sintetizó a partir del emparejamiento de un ADN M13mp18 monocatenario (ss) linealizado de 7,2 kpb (GuildBiosciences) con 190 oligonucleótidos complementarios mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick para producir ADNds completo durante un período de 1 h en un termociclador. Todos los oligonucleótidos fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies y se disolvieron en IDTE (Tris-HCl 10 mM y ácido etilendiaminotetraacético 0,1 mM, pH 8,0), y las secuencias se pueden encontrar en Información complementaria. Luego, la muestra se filtra utilizando un filtro Amicon de 100 kDa y se mide en un espectrofotómetro de nanogota para obtener información sobre la concentración. Según la medición de nanogotas, el rendimiento típico es del 75 al 95 %. Para las nanoestructuras en la Fig. 1, dentro de los 190 oligos hay cinco grupos de motivos simples de horquillas con mancuernas igualmente espaciados para crear los picos que actúan como un código de barras en la nanoestructura de ADN. Cada grupo consta de 11 mancuernas de ADN para crear un único pico. Las secuencias exactas con sus números se muestran en la Tabla complementaria 1 en Información complementaria después de un trabajo anterior7. El saliente se creó reemplazando los oligos nos. 142 y 143 con un oligo de 90 pb compuesto por segmentos de 30 pb para coincidir con la columna vertebral de M13 y 50 pb de las secuencias específicas que contienen las secuencias objetivo que pretendíamos probar. El exceso de ADNds de 50 pb no es lo suficientemente grande como para generar un bloqueo actual que pueda observarse. Estos salientes se proporcionan en la Tabla complementaria 2 para los experimentos de la Fig. 2 y en la Tabla complementaria 3 para los experimentos de la Fig. 4. Para la segunda nanoestructura, que se muestra en la Fig. complementaria 3, oligos no. 44, 45, 81, 82, 118 y 119 se reemplazaron con secuencias salientes como se encuentra en la Tabla complementaria 4. Las mancuernas se fabricaron reemplazando los oligos no. 23–28, 60–65, 97–102, 134–139, 148–153 y 162–167 con las secuencias de la Tabla complementaria 5. Todas las muestras se almacenaron en un tampón de almacenamiento de Tris 10 mM y MgCl2 0,5 mM.

Cas9 D10A/H10A (dCas9) desactivado catalíticamente de Streptococcus pyogenes se une a un ARNtracr y a un ARN de secuencia específica (ARNcr), ambos sintetizados por Integrated DNA Technologies y disueltos en IDTE (Tris-HCl 10 mM y ácido etilendiaminotetraacético 0,1 mM, pH 8,0). ). Las secuencias objetivo del ARNcr para las sondas se diseñaron utilizando un software en línea (//chopchop.cbu.uib.no/)39 y se pueden encontrar en Información complementaria. Para ensamblar las RNP de dCas9, se incubaron el ARNtracr (200 nM), el ARNcr (250 nM) y el dCas9 (100 nM) en un tampón bajo en sal (HEPES-NaOH 25 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y MgCl2 1 mM. ) a 25 °C durante al menos 20 min.

Luego, las sondas dCas9 ensambladas se incubaron con las nanoestructuras de ADN durante al menos 20 minutos a 25 °C, y las sondas dCas9 se agregaron en exceso de típicamente 15 sondas dCas9 por sitio de unión al ADN. Las muestras que contienen nanoestructuras de ADN marcadas con dCas9 se diluyen a 0,1–0,3 nM en una solución tampón de LiCl 2 M, 1 × TE o LiCl 4 M, 2 × TE, dependiendo de la nanoestructura, inmediatamente antes del inicio de la medición en el nanoporo. sistema.

Los nanoporos se fabrican a partir de capilares de cuarzo disponibles comercialmente (0,2 mm de diámetro interior/0,5 mm de diámetro exterior Sutter Instruments) utilizando un extractor de pipetas asistido por láser (P-2000, Sutter Instrument) hasta aproximadamente 15 nanómetros. Produjimos un chip de polidimetilsiloxano (PDMS) con 16 nanoporos cónicos con un depósito cis comunitario y depósitos trans individuales. Las instrucciones detalladas para la producción se pueden encontrar en Bell et al.45. Los electrodos de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl) están conectados a los depósitos cis y trans en el chip de polidimetilsiloxano. El tamaño de cada nanoporo se estima antes de comenzar las mediciones tomando una curva de corriente-voltaje en el electrolito de referencia. El depósito cis central contiene la muestra y está conectado a tierra, mientras que se aplica un voltaje de polarización de 500 mV al depósito trans para impulsar el transporte de ADN a través del nanoporo. Luego, la medición se toma hasta que se reúnen alrededor de 1000 eventos plegados y desplegados, con un rango de tiempo típico de 45 min a 2 h dependiendo de la concentración utilizada y el nanoporo. Normalmente, de estos 1.000 eventos, 300 se desglosan y luego se analizan. En la figura complementaria 6 se puede ver un ejemplo de los eventos plegados y desplegados.

Se utilizó el amplificador de abrazadera de parche Axopatch 200B (Molecular Devices) para recopilar señales de corriente. La configuración funciona en modo de celda completa con el filtro interno configurado en 100 kHz. Para reducir el ruido, también se utiliza un filtro Bessel de paso bajo analógico de ocho polos (900CT, Frequency Devices) con una frecuencia de corte de 50 kHz. El voltaje aplicado se controla a través de un convertidor analógico a digital de E/S (tarjetas DAQ, PCIe-6251, National Instruments), utilizando un programa en LabView 2016 para registrar simultáneamente la señal actual en un ancho de banda de 250 kHz.

Desde la GUI de Labview, los datos experimentales se almacenan como archivos de transmisión de gestión de datos técnicos (TDMS). Primero, se utiliza un script Python del buscador de translocaciones (parte del paquete nanopyre que se encuentra en https://gitlab.com/keyserlab/nanopyre) que identifica los eventos de los rastros sin procesar y los almacena en un archivo hdf5. Después del análisis inicial del buscador de translocaciones, los eventos de los archivos hdf5 se leen en Python (usando el paquete nanopro https://gitlab.com/keyserlab/nanopro) y se descartan todos los eventos con ruido actual >15 pA. Los parámetros para encontrar los picos se basan en el análisis manual de los parámetros de umbral, altura, distancia y prominencia del paquete Python Peakfinder. Esto se prueba en los diez primeros y diez últimos eventos para garantizar que los parámetros sean consistentes y encuentren los picos con precisión. A continuación, los eventos se clasifican según el número de picos. Después de la clasificación, los eventos se analizan visualmente y los eventos que tienen pliegues o nudos que interfieren con el código de barras se descartan. Nuestro laboratorio ha demostrado que tan solo cuatro eventos son suficientes para una detección positiva en la mayoría de los casos, mientras que nueve eventos correctos aumentan la probabilidad de detección positiva a más del 90% (ref. 46). Porcentaje de eventos con dCas9 unido en las Figs. 2b y 4 se calcula de la siguiente manera:

En estas ecuaciones, N11111 dCas9 representa el número de eventos con el código de barras 11111 vinculado a dCas9. N11111 No dCas9 representaría el número de eventos con el código de barras 11111 y sin dCas9 vinculado.

Los cálculos de concentración relativa tienen parámetros adicionales porque el número total de eventos sin dCas9 unido a ambas nanoestructuras con código de barras también influye. Siempre hay algún porcentaje de error en los experimentos de concentración; por lo tanto, para tener en cuenta eso, el porcentaje normalizado de cuentas para el número total de eventos con un código de barras determinado medido en el nanoporo. Para los eventos de la Fig. 2c, d, se utilizan las siguientes ecuaciones:

La primera parte de esta fórmula simplemente analiza eventos con dCas9 unido \(\frac{{N}_{11111{\,{\mathrm{dCas}}}9}}{{N}_{11111{\,{\ mathrm{dCas}}}9}+{N}_{11001{\,{\mathrm{dCas}}}9}}\), mientras que la segunda parte implica multiplicar por el número total de eventos con el código de barras que se está midiendo ( N11111 No dCas9 + N11111 dCas9). Esto normaliza las mediciones en función de las concentraciones relativas que se miden en el nanoporo.

Para la Fig. 3, se utiliza una nanoestructura diferente y los valores de las proporciones normalizadas se cambian en consecuencia. Las proporciones se calculan de las siguientes maneras:

Esta relación de normalización es ligeramente diferente y se basa en la eficacia de unión del ARNg objetivo a su secuencia de ADN objetivo. Cada \({X}_{{{\mathrm{Position}}\; i}}\) representa una falta de coincidencia diferente. XControl definido como \(\frac{{\Sigma X}_{{{\mathrm{Control}}\; {\mathrm{Position}}}\mathrm{1,2,3}}}{3}\) es la eficiencia de unión promedio en cada posición del dCas9 objetivo a su secuencia de ADN objetivo. Esto trata la relación medida del RNP dCas9 con respecto a su objetivo como una relación de unión de 1,0 y las otras relaciones medidas en relación con eso.

La eficiencia de unión (%) se calcula:

Para las muestras con mediciones múltiples, como se describe en el texto, la desviación estándar de la población se calculó utilizando lo siguiente:

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos principales que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el artículo y en su información complementaria. Los datos originales sin procesar generados en este estudio están disponibles en https://doi.org/10.17863/CAM.96534.

Para la adquisición de datos se utilizó LabView 2016. El servidor CHOPCHOP (versión 3) está disponible en https://chopchop.cbu.uib.no. El código Python para la instalación local está disponible en https://bitbucket.org/valenlab/chopchop. Los scripts de análisis de datos de nanoporos están disponibles en https://gitlab.com/keyserlab/nanopyre y https://gitlab.com/keyserlab/nanopro.

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SES reconoce la financiación de Oxford Nanopore Technologies, el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC) y Cambridge Trust. NEW reconoce la financiación de Oxford Nanopore Technologies, la Fundación Canadá Reino Unido y la Oficina de Asuntos Postdoctorales de la Universidad de Cambridge. SY reconoce la financiación del EPSRC (EP/S022953/1) y AD reconoce la financiación del EPSRC (EP/L015889/1). UFK y KC reconocen la financiación a través del Consejo Europeo de Investigación (ERC-2019-POC PoreDetect 899538). Agradecemos a Z. Xuan y N. Ermann por ayudar en el desarrollo de herramientas de análisis de datos y a C. Platnich por la útil lectura del manuscrito y sus útiles sugerencias.

Nicole E. Weckman

Dirección actual: Instituto de Estudios en Educación y Práctica Transdisciplinaria de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Química Aplicada, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá

Sara Yorke

Dirección actual: Yusuf Hamied Departamento de Química, Cambridge, Reino Unido

Akashaditya Das

Dirección actual: Departamento de Ingeniería Química, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Laboratorio Cavendish, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Sarah E. Sandler, Nicole E. Weckman, Sarah Yorke, Kaikai Chen y Ulrich F. Keyser

Departamento de Patología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Akashaditya Das

Oxford Nanopore Technologies, Oxford Science Park, Oxford, Reino Unido

Richard Gutiérrez

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SES, NEW, RG y UFK concibieron la idea. SES, NEW y KC diseñaron las nanoestructuras. AD asesoró sobre el diseño de la guía dCas9. SES y SY realizaron los experimentos y analizaron los datos de los nanoporos. SES, NEW y UFK escribieron el borrador inicial del manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la discusión y a la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Ulrich F. Keyser.

NEW es cofundador y consultor de 52 North Health Ltd. RG es empleado de Oxford Nanopore Technologies. SES está parcialmente financiado por Oxford Nanopore Technologies para su doctorado. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Biomedical Engineering agradece a Kiana Aran, Weihua Guan y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Figuras, tablas y referencias complementarias.

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Sandler, SE, Weckman, NE, Yorke, S. et al. Detección de la tolerancia al desajuste del ADN de Cas9 catalíticamente inactivo a través de nanoestructuras de ADN con códigos de barras en nanoporos de estado sólido. Nat. Biomédica. Ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01078-2

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Recibido: 19 de octubre de 2022

Aceptado: 30 de junio de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01078-2

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