Célula progenitora cardíaca - Grupo Co., Ltd del soldador láser de Hengyang

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 800 (2023) Citar este artículo

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Las vesículas extracelulares (EV) son partículas encerradas en una bicapa lipídica derivada de células que desempeñan un papel en la comunicación intercelular. Se ha demostrado que las EV derivadas de células progenitoras cardíacas (CPC) protegen el miocardio contra la lesión por isquemia-reperfusión a través de efectos proangiogénicos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la angiogénesis inducida por CPC-EV siguen siendo difíciles de alcanzar. Aquí, descubrimos que la capacidad de los CPC-EV para inducir la angiogénesis in vitro y estimular vías de supervivencia se perdió tras la exposición de las células del donante EV al ionóforo de calcio. La comparación proteómica de preparaciones de EV activas y no activas junto con el análisis fosfoproteómico de células endoteliales activadas identificó la contribución de la proteína candidata PAPP-A y la vía de señalización del IGF-R en la activación celular mediada por EV, que se validó aún más mediante ensayos de angiogénesis in vitro. . Tras una purificación adicional mediante ultracentrifugación en gradiente de iodixanol, los vehículos eléctricos perdieron parcialmente su actividad, lo que sugiere un papel coestimulador de las proteínas coaisladas en la activación de las células receptoras. Nuestra mayor comprensión de los mecanismos de activación celular mediada por CPC-EV allanará el camino hacia terapias basadas en EV más eficientes.

El infarto de miocardio causa una pérdida masiva de cardiomiocitos, lo que resulta en la formación de cicatrices y remodelación cardíaca que conducen a una función cardíaca deteriorada y progresivamente al desarrollo de insuficiencia cardíaca. Aunque la insuficiencia cardíaca no se puede prevenir con las terapias disponibles actualmente, estudios recientes en animales han demostrado que la función cardíaca después de un infarto de miocardio puede mejorarse mediante la aplicación terapéutica de vesículas extracelulares (EV) derivadas de células progenitoras cardíacas y madre (CPC)1,2 .

Los vehículos eléctricos son nanopartículas derivadas de células encerradas por una bicapa lipídica que contiene una carga biológica que incluye ARN, proteínas y lípidos y desempeña un papel en la homeostasis celular normal y la comunicación intercelular3. Los vehículos eléctricos tienen la capacidad de activar células diana mediante la presencia de moléculas y receptores de adhesión y mediante la entrega de moléculas bioactivas derivadas de la célula madre2,4. Después de la administración in vivo, los EV liberados por las CPC Sca+ modulan los procesos regenerativos en el corazón al promover la angiogénesis, disminuir la fibrosis e inhibir la apoptosis de los cardiomiocitos y contribuir así a la reparación cardíaca5,6. Se ha demostrado que los vehículos eléctricos derivados de otras fuentes de células madre administran distintos miARN y proteínas a diferentes células del corazón para promover la recuperación cardíaca7,8,9. A pesar de los intentos de documentar la composición de CPC-EV, sigue habiendo una falta de estudios funcionales y mecanicistas que aclaren exactamente qué componentes del complejo repertorio de proteínas son responsables de la función reparadora. Además, la aplicación clínica de vehículos eléctricos derivados de células madre se ve obstaculizada por problemas de reproducibilidad relacionados con diferencias en la actividad terapéutica entre diferentes aislamientos de vehículos eléctricos, entre otros10,11. La cromatografía de exclusión molecular (SEC) se ha adoptado ampliamente como método preferible para el aislamiento de EV12,13. Sin embargo, como ocurre con la mayoría de los métodos hasta la fecha, no produce una población de vehículos eléctricos completamente pura. Se ha especulado que las proteínas coaisladas presentes en las preparaciones de EV pueden contribuir a su función terapéutica14,15,16,17,18. Por lo tanto, se necesita una caracterización funcional más profunda del contenido de CPC-EV y la localización de este contenido en preparaciones de CPC-EV para obtener una mejor comprensión de los mecanismos de acción que conducen a una aplicación terapéutica más reproducible de los CPC-EV. En este estudio, nos propusimos desentrañar los efectos mediados por proteínas de los CPC-EV en las células endoteliales. Primero, identificamos los componentes proteicos funcionales de los CPC-EV involucrados en la activación de las células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) comparando el contenido de preparaciones de EV funcionales y no funcionales (CPC-). A continuación, estudiamos la contribución de las proteínas individuales asociadas a EV, la proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A) y Nidogen-1 (NID1) a la angiogénesis mediada por CPC-EV mediante la generación de EV knock-out (KO) que emplean CRISPR. /Tecnología Cas9. Por último, investigamos la contribución de las proteínas asociadas a EV frente a las coaisladas a la función de CPC-EV mediante el empleo de una purificación basada en gradiente de densidad de iodixanol.

En el corazón, se demostró que los efectos proreparativos provocados por la administración de CPC y EV derivados de CPC están mediados por la promoción de la angiogénesis19,20,21. Para confirmar el potencial proangiogénico de nuestros CPC-EV in vitro, los EV se aislaron de un medio condicionado sin suero utilizando SEC como se describió anteriormente12. NTA confirmó el aislamiento exitoso de CPC-EV, que demostró una distribución de tamaño con un pico a ~ 90 nm (Fig. 1a). La transferencia Western, de acuerdo con las pautas de MISEV201822, confirmó el enriquecimiento relativo de las proteínas marcadoras de EV CD81, CD63 y anexina A1 en EV en comparación con el lisado celular y la ausencia de la proteína del retículo endoplasmático Calnexin (Fig. 1b). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la preparación de CPC-EV demostró la presencia de vesículas que contienen una membrana de doble valva (Fig. 1c). La carga superficial (potencial zeta) de los vehículos eléctricos fue negativa, −19,3 mV, medida mediante electroforesis láser Doppler (Fig. 1d).

Un gráfico NTA representativo que muestra la distribución de tamaño y la concentración de partículas de EV aislados del medio acondicionado de CPC (CPC-EV) mediante cromatografía de exclusión por tamaño. b Análisis de transferencia Western que muestra la presencia de CD81, CD63, anexina A1 (ANXA1), β-actina (β-ACT) y ausencia de calnexina (CNX) en CPC-EV. β-ACT y CNX estaban presentes en el lisado de CPC (CL). c Imagen TEM representativa de CPC-EV. d Carga superficial (potencial zeta) de CPC-EV medida mediante electroforesis láser Doppler. e, f Análisis de transferencia Western representativo de AKT fosforilada (pAKT), AKT total (tAKT), ERK1/2 fosforilada (pERK1/2) y ERK1/2 total (tERK1/2) en HMEC-1 tratado con dos CPC-EV diferentes dosis de partículas (dosificación basada en ref. 12). f Cuantificación de los niveles de expresión de pAKT, tAKT, pERK1/2 y tERK1/2 mediante densitometría expresada como relaciones pAKT/AKT y pERK/ERK (n = 4). g Ensayo de cicatrización de heridas que muestra los efectos de los CPC-EV en la migración de HMEC-1 6 h (t6) después de la adición de EV (t0), analizado como porcentaje relativo de cierre de la herida y distancia de migración absoluta relativa en comparación con PBS (n = 3). Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,033; **p<0,0021.

Estudios anteriores han demostrado la activación de las vías de señalización de la proteína quinasa1/2 activada por mitógenos (MAPK1/2), quinasa regulada por señales extracelulares1/2 (ERK1/2) y PI3 quinasa/AKT en HMEC-1 tras la administración de CPC-EV12. De hecho, los niveles de fosforilación de AKT y ERK1/2 aumentaron dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de CPC-EV de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1e, f). La capacidad de los CPC-EV para activar funcionalmente las células endoteliales se determinó en un ensayo de herida por raspado HMEC-1. La adición de 2 × 1010 CPC-EV a la migración celular inducida por HMEC-1 rayada según lo determinado por el porcentaje de cierre y la distancia de migración absoluta en comparación con PBS (Fig. 1g), sin afectar el número total de células según lo determinado por el contenido total de proteínas en HMEC -1 lisados (Figura complementaria 1a). Esto validó la actividad proangiogénica de los CPC-EV in vitro.

Para investigar mejor el contenido de CPC-EV pro-migratorio, primero nos propusimos inducir la liberación de CPC-EV. Se ha descrito que el ionóforo de calcio A23187 estimula la liberación de EV mediante el aumento de los niveles de calcio intracelular23,24,25,26. Para investigar la liberación de EV inducida por ionóforo de calcio por parte de las CPC, las CPC se dejaron sin tratar (DMSO al 0,0125%, veh-EV) o se expusieron a ionóforo de calcio 1 µM (ión Ca-EV) durante 24 h. Luego se aislaron los EV del medio condicionado sin suero mediante SEC. El tamaño y el número total de vehículos eléctricos liberados no se vieron afectados por la exposición del CPC al ionóforo de calcio, según lo determinado por NTA (Fig. 2a). TEM confirmó la presencia de partículas redondas encerradas en membranas en ambas preparaciones de EV (Fig. 2b). Ambos aislados de EV mostraron proteínas marcadoras de EV CD81, CD9 y ALIX, aunque su presencia se redujo en los EV de iones de Ca (Fig. 2c). Los vehículos eléctricos de iones de Ca tenían un contenido de proteína total ligeramente menor por 1 × 1010 partículas en comparación con los vehículos eléctricos veh (Fig. 2d). Por lo tanto, en experimentos posteriores, para evitar sesgos en la interpretación de la funcionalidad de los EV causados por diferencias en la pureza de los EV, la suplementación con EV se normalizó entre las condiciones tanto en el número total de partículas como en la cantidad total de proteínas. En particular, la estimulación con veh-EV indujo la fosforilación de AKT y ERK1/2 en HMEC-1, mientras que la estimulación con iones Ca-EV no lo hizo, cuando la adición de EV se normalizó en función del número de partículas (Fig. 2e, f, Fig. complementaria 9a, b). ) y en los niveles de proteína total (Fig. 2g, h, Fig. complementaria 9c). Los vehículos eléctricos liberados de células SKOV-3 se aislaron y caracterizaron simultáneamente, ya que previamente se demostró que no podían inducir la señalización de AKT y ERK1/2 (Figuras complementarias 1b, c). De hecho, los SKOV-3-EV fueron ineficaces para inducir la fosforilación de AKT y ERK1/2 en comparación con los veh-EV (Figuras complementarias 1d-g) y, por lo tanto, se incluyeron como control de células no madre no funcionales. Además, la estimulación veh-EV, pero no la estimulación con iones Ca-EV, indujo la migración de HMEC-1 en un ensayo de raspado de cierre de herida (Fig. 2i) y estimuló la formación de brotes en un ensayo de brotes de HMEC-1 (Fig. 2j, k). Estas diferencias en la funcionalidad de los EV sugieren que el tratamiento con ionóforo de calcio, aunque no aumenta la liberación total de EV, afecta el contenido de EV. Este hallazgo para aislar poblaciones de EV tanto funcionales como no funcionales de las CPC se utilizó para explorar más a fondo las vías de señalización que contribuyen a la activación celular mediada por CPC-EV.

Un gráfico NTA representativo que muestra la distribución de tamaño y la concentración de partículas de vehículos eléctricos aislados del mismo volumen de CPC estimuladas con vehículo (0,0125% DMSO; veh-EV) o ionóforo de calcio (ión Ca-EV). b Imágenes TEM representativas de vehículos eléctricos y vehículos eléctricos de iones de Ca. ( c ) Análisis de transferencia Western que muestra la presencia de CD81, CD9, ALIX, β-actina (β-ACT) y ausencia de Calnexin (CNX) en vehículos eléctricos de iones veh y Ca. β-ACT y CNX estaban presentes en el lisado de CPC (CL). d Contenido de proteína por 1 × 1010 VEh- y Ca ion-EV de tres triplicados biológicos. e – h Análisis de transferencia Western representativo de AKT fosforilada (pAKT), AKT total (tAKT), ERK1/2 fosforilada (pERK1/2) y ERK1/2 total (tERK1/2) en HMEC-1 tratado con veh- y ion Ca -EV normalizados con dos dosis de (e, f) número de partículas de EV o (g, h) contenido de proteína total de EV. Se incluyó β-ACT como proteína de mantenimiento. f, h Cuantificación de los niveles de expresión de pAKT, tAKT, pERK1/2 y tERK1/2 mediante densitometría expresada como relaciones pAKT/AKT y pERK/ERK (n = 4 y n = 3). Las réplicas biológicas de (e, g) también se muestran en las figuras complementarias 9a-c. i Ensayo de cicatrización de heridas que muestra los efectos de 2 × 1010 o 1 µg de vehículos eléctricos y vehículos eléctricos de iones Ca sobre la migración de HMEC-1 (n = 3). j Ensayo de brotación que muestra la formación de brotes de HMEC-1 inducida por veh y Ca ion-EV en cuentas, analizado como (k) longitud media por brote y longitud total de brote por cuenta (n = 3, réplicas técnicas. Los datos son representativos de dos experimentos biológicamente independientes). Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,033; **p < 0,0021, ***p < 0,0002.

Para obtener información sobre el mecanismo de activación celular mediada por CPC-EV, las vías de transducción de señales activadas tras la estimulación con HMEC-1 con VEh funcionales, iones Ca-EV no funcionales y control negativo (PBS) se caracterizaron mediante fosfoproteómica (Figura complementaria .2). Al comparar las células HMEC-1 tratadas con veh-EV con PBS después de 30 minutos de estimulación, se observaron cambios significativos específicamente en el nivel de fosfoproteoma, independientemente de la regulación del proteoma (Fig. 3a). Los análisis de fosfoproteoma fueron altamente sensibles, identificando ~ 6900 fosfositos de clase I (con probabilidad de localización de fosfomodificación> 0,75) a partir de solo 50 µg de lisados de HMEC-1. La agrupación jerárquica de los fosfositos que cambiaron significativamente reveló un grupo con una mayor fosforilación en HMEC-1 tratado con veh-EV en comparación con el HMEC-1 tratado con PBS y Ca ion-EV (Fig. 3b, grupo discontinuo C1). Para comprender mejor qué vías de señalización intracelular fueron activadas por los veh-EV, los fosfositos presentes en el grupo C1 (n = 195) se anotaron adicionalmente contra las vías PANTHER. La cascada MAPKK / MAPK de la vía de insulina / IGF, las vías de señalización de Ras e interleucina se identificaron como las vías más enriquecidas en HMEC-1 (Fig. 3c). Además, los fosfositos significativamente alterados entre HMEC-1 estimulados por veh y Ca ion-EV incluían miembros de las vías de señalización PI3K-AKT y MAPK (resaltadas en la Fig. 3d). Esto demuestra las vías intracelulares específicas implicadas en la activación de HMEC-1 mediada por CPC-EV.

a Gráficos de volcán que muestran cambios en (i) proteoma y (ii) fosfoproteoma de HMEC-1 después de la estimulación con veh-EV en comparación con el control negativo (PBS). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba T de Student, y las proteínas que cambian significativamente (valor de p ≤ 0,05 y cambio >2) en HMEC-1 tratado con veh-EV se resaltan en rojo, mientras que las proteínas que cambian significativamente en PBS se resaltan en azul. b Agrupación jerárquica de 1549 fosfositos que cambian significativamente (ANOVA, valor q ≤ 0,05) encontrados en HMEC-1 tras la estimulación con veh-EV, Ca ion-EV y PBS. El grupo C1, incluida la fosforilación específica inducida por veh-EV, está resaltado con líneas discontinuas. c PANTHER Análisis de enriquecimiento de la vía de las fosfoproteínas encontradas en los grupos C1, clasificados según el número de enriquecimiento. *= FDR < 0,05, **= FDR < 0,01, ***= FDR < 0,005. d Gráfico de volcán que muestra los cambios en el fosfoproteoma de HMEC-1 tras veh-EV en comparación con la estimulación con iones Ca-EV, también representado en la Fig. 6a. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba T de Student, y los fosfositos que cambiaron significativamente (valor de p <0,05 y cambio de veces >2) después del tratamiento con veh-EV se resaltan en rojo, mientras que los fosfositos que cambiaron significativamente después del tratamiento con iones Ca-EV se resaltan en azul.

Los CPC-EV inducen la activación de la señalización intracelular dentro de los 30 minutos posteriores a la administración a HMEC-1 (Figs. 1e, 3a), lo que sugiere un papel para las interacciones directas receptor-ligando de los EV con la membrana celular objetivo. Para determinar la contribución de las proteínas asociadas a EV a la funcionalidad de CPC-EV, se eliminaron las proteínas de superficie de CPC-EV y los dominios receptores extracelulares de las proteínas transmembrana mediante tratamiento con 100 µg/ml de proteinasa K. Posteriormente, los EV tratados con proteinasa K y los EV no tratados se sometieron a una segunda separación por SEC para eliminar fragmentos de proteínas libres de los vehículos eléctricos. Se verificó una reducción en los niveles de proteína en los vehículos eléctricos tratados con proteinasa K mediante análisis microBCA (Fig. 4a), y NTA demostró que el tamaño de los vehículos eléctricos no se vio afectado por el tratamiento con proteinasa K (Fig. 4b). Los análisis de transferencia Western confirmaron la eliminación de la proteína de superficie CD81 de EV en los vehículos eléctricos tratados con proteinasa K, mientras que la proteína intravesicular Syntenin-1 no se vio afectada (Fig. 4c). Los vehículos eléctricos tratados con proteinasa K fueron menos potentes para inducir la fosforilación de AKT en HMEC-1 en comparación con los vehículos eléctricos no tratados (Fig. 4d, e, Fig. complementaria 9d), lo que confirmó una contribución importante de las proteínas asociadas a CPC-EV a HMEC- 1 activación.

a Contenido de proteína por 1 × 1010 EV tratados con (+) y sin (-) Proteinasa K (Prot K) de dos experimentos representativos. b Gráfico NTA representativo que muestra la distribución de tamaño y la concentración de partículas de ambas poblaciones de EV después de un segundo aislamiento SEC. c Análisis de transferencia Western que muestra la ausencia y presencia de CD81 en vehículos eléctricos tratados con Prot K (+) y no tratados (-), respectivamente. Syntenin-1 (SYNT) y β-actina (β-ACT) estuvieron presentes en ambas poblaciones de EV, mientras que estuvieron ausentes en Calnexin (CNX). β-ACT y CNX estaban presentes en el lisado de CPC (CL). d Análisis de transferencia Western representativo de AKT fosforilado (pAKT) y AKT total (tAKT) en HMEC-1 estimulado con Prot K- (+) y CPC-EV no tratados (-) normalizados con dos dosis de números de partículas de EV. e Cuantificación de pAKT y tAKT, niveles de expresión mediante densitometría expresados como relación pAKT/AKT (n = 3). La réplica biológica de (d) se muestra en la figura complementaria 9d. Los datos se presentan como media ± DE. **p < 0,0021, ***p < 0,0002.

A continuación, buscamos identificar las proteínas CPC-EV involucradas en la activación de la señalización intracelular y la migración de HMEC-1, empleando las diferencias en la funcionalidad entre veh-, Ca ion- y SKOV-3-EV. La identificación de proteínas expresadas diferencialmente entre vehículos eléctricos veh funcionales y vehículos eléctricos de iones de Ca no funcionales liberados del mismo donante de CPC elimina las proteínas expresadas diferencialmente debido a diferencias en el donante de células, mientras que los vehículos eléctricos SKOV-3 se incluyeron como vehículos no funcionales no funcionales adicionales. control celular. Utilizando una estrategia proteómica imparcial y sin etiquetas, comparamos cuantitativamente el proteoma EV total entre las tres fuentes. A partir de esto, se identificaron con seguridad 2077 proteínas (1% FDR) entre todas las poblaciones de vehículos eléctricos. De estas, se detectaron 1293 proteínas en al menos 2 de las 3 réplicas biológicas para cada población de EV (Fig. 5a), de las cuales exploramos más a fondo las 209 proteínas que se alteraron significativamente entre veh-EV y Ca ion-EV (Fig. .5b, i), y 146 proteínas entre veh-EV y SKOV-3-EV (Fig. 5b, ii). El enriquecimiento de PAPP-A, gen 6 estimulado por el factor de necrosis tumoral (TSG-6) y subunidad gamma 1 de laminina (LAMC1) en veh-EV en comparación con Ca ion-EV se validó mediante transferencia Western (Fig. 5c).

a Mapa de calor de la abundancia de proteínas (log2) de las proteínas identificadas en cada réplica biológica (veh-, ion Ca y SKOV-3-EV), identificadas por LC-MS/MS. b Gráficos de volcán que muestran cambios promedio en la abundancia de proteínas (log2) de proteínas identificadas en veh-EV en comparación con (i) Ca ion-EV y (ii) SKOV-3-EV. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba T de Student, y las proteínas que cambian significativamente (valor de p ≤ 0,05 y cambio de veces >2) en vehículos eléctricos se resaltan en rojo, mientras que las proteínas que cambian significativamente en vehículos eléctricos de ion Ca y SKOV-3 están resaltados en azul. c Análisis de transferencia Western que confirma el enriquecimiento de las proteínas NID1, TSG-6, LAMC1, PAPP-A, CD81 y β-actina (β-ACT) identificadas por MS en veh-EV en comparación con Ca ion-EV. CNX estaba presente únicamente en el lisado de CPC (CL). Las transferencias completas de β-ACT, PAPP-A y NID1 se muestran en la figura complementaria 10. d Diagrama de Venn que muestra el número de proteínas con un enriquecimiento significativo >2 veces (p ≤ 0,05) en veh-EV en comparación con iones Ca y SKOV -3-EV y superposición entre esas dos poblaciones. e Análisis de ontología genética utilizando PANTHER de procesos biológicos enriquecidos para las 105 proteínas superpuestas, que representa el número de proteínas identificadas en cada grupo, clasificadas según el valor p corregido más pequeño (−log10 (FDR)).

Un análisis más detallado de las proteínas significativamente enriquecidas en veh-EV reveló 105 proteínas consistentemente enriquecidas en veh-EV en comparación con las poblaciones de iones Ca y SKOV-3-EV (top 20 en la Tabla complementaria 2), mientras que 104 y 41 proteínas estaban enriquecidas exclusivamente en comparación con Ca ion-EV y SKOV-3-EV, respectivamente (Fig. 5d). La lista completa de proteínas enriquecidas con veh-EV (n = 105) fue comentada adicionalmente por Gene Ontology, que reveló una sobrerrepresentación de procesos biológicos como la "adhesión biológica", la "adhesión celular" y la "regulación de la migración celular" (Fig. .5e). En conjunto, estos confirman que los efectos de los CPC-EV en las células endoteliales observados pueden estar mediados por un subconjunto colectivo de proteínas EV que promueven la migración de las células endoteliales.

Tras el análisis más crudo del proteoma CPC-EV, investigamos la contribución de proteínas individuales a la funcionalidad de CPC-EV. El análisis proteómico de EM identificó PAPP-A y NID1, proteínas que previamente se demostró que contribuyen a los mecanismos de reparación cardíaca7,27, entre las 20 proteínas más fuertemente enriquecidas en veh-EV en comparación con los iones Ca y SKOV-3-EV (Fig. 5b , Figura complementaria 4a, Tabla complementaria 2). Un mecanismo propuesto de la función de PAPP-A es a través de su expresión en la superficie del EV mediante la unión a glicosaminoglicanos en la membrana del EV (Fig. 6a)7. Mediante la escisión de IGFBP4 del complejo IGF-1/IGFBP4, induce la liberación de IGF-1 en el espacio extracelular y la posterior activación de la señalización intracelular mediante la unión a IGF-R28. El análisis del fosfoproteoma en HMEC-1 tras la estimulación con veh-EV reveló la activación específica de la cascada MAPKK/MAPK de la vía insulina/IGF (Fig. 3c) e identificó la fosforilación de miembros de las cascadas de señalización MAPK y AKT-mTOR, incluido IRS2. , RAF1, MEK2, AKT y mTOR (Fig. 6a). Para estudiar la contribución del receptor de IGF (IGF-R) a la señalización intracelular tras la estimulación con EV, empleamos el inhibidor de IGF-R picropodofilina (PPP). PPP anuló de manera dependiente de la dosis el aumento en la fosforilación de ERK1/2 y AKT en HMEC-1 tras la estimulación con CPC-EV (Fig. 6b, Fig. Suplementaria 9g, h), lo que demuestra una contribución de la vía de señalización de IGF-R en HMEC-1 activación. NID1 es una glicoproteína presente en la membrana basal, que promueve la migración celular al estar presente en vehículos eléctricos derivados de células de carcinoma hepatocelular29. Curiosamente, la transferencia Western confirmó la expresión de NID1 en veh-EV, pero también mostró la presencia de una forma NID1 de mayor peso molecular en Ca ion-EV (Fig. 5c). Esto podría deberse a diferencias en el estado de glicosilación de NID1 y al sesgo hacia la detección de péptidos no glicosilados mediante nuestro análisis de EM.

a Esquema que representa el mecanismo hipotético de señalización (intra) celular activada por PAPP-A asociada a EV, basado en proteínas identificadas y fosfositos significativamente alterados medidos en HMEC-1 tras la estimulación de veh-EV mediante análisis (fofo) proteómico. Las proteínas detectadas en HMEC-1 se muestran en gris, mientras que los fosfositos que cambian significativamente presentes en el grupo C1 (ver Fig. 3d) se muestran en marrón. b Análisis de transferencia Western representativo de AKT fosforilada (pAKT), AKT total (tAKT), ERK1/2 fosforilada (pERK1/2) y ERK1/2 total (tERK1/2) en HMEC-1 tratado con 6 × 1010 o 2 × 1010 CPC-EV, o con 200 ng/ml de IGF-1 libre después de la preincubación con diferentes dosis de picropodofilina (PPP). Se incluyó β-actina (β-ACT) como proteína de mantenimiento (I = transferencia de proteína fosforilada, II = transferencia de proteína total). Las réplicas biológicas de (b) se muestran en la figura complementaria 9g, h. c Resultados de la secuenciación de Sanger que confirman la inserción de 1 pb en el exón 3 de PAPPA en el sitio objetivo CRISPR/Cas9 del clon PAPPA KO-CPC, en comparación con la línea CPC policlonal de NTgRNA. d Análisis de transferencia Western que muestra la ausencia de PAPP-A en PAPPA KO-EV, en comparación con NTgRNA-EV; la presencia de CD81, CD63, Syntenin-1 (SYNT), Flotillin (FLOT1), β-ACT y ausencia de Calnexin (CNX) en ambas poblaciones de EV. FLOT1, β-ACT y CNX estaban presentes en el lisado de CPC (CL). e Gráfico NTA representativo que muestra la distribución de tamaño y la concentración de partículas de PAPPA KO- y NTgRNA-CPC-EV. f Contenido de proteína por 1 × 1010 PAPPA KO- y NTgRNA-EV de dos experimentos representativos.

Para investigar la influencia de PAPP-A y NID1 en la activación de células endoteliales mediada por EV, se empleó tecnología CRISPR/Cas9 para desactivar (KO) PAPP-A y NID1 en CPC. Se seleccionaron tres ARNg diferentes dirigidos al exón 3 y 4 de PAPPA y a la región 5'UTR y al exón 1 de NID1 para identificar el sitio objetivo más apropiado en PAPPA o NID1 para la edición de genes, respectivamente, y su eficiencia de escisión del ADN genómico se determinó utilizando el ensayo de endonucleasa T7 (Figuras complementarias 4b, 5a). Con base en la eficiencia de escisión del ADN más potente, seleccionamos gRNA 1 y 2 para PAPP-A y gRNA 3 para NID1 para la generación de líneas KO CPC. La secuenciación de Sanger reveló una población mixta de alelos mutados en los sitios objetivo del ARNg (Figuras complementarias 4c, 5b). Se generaron clones individuales a partir de estas líneas CPC KO mediante expansión clonal y la presencia de deleciones o inserciones bialélicas homocigotas se determinó mediante secuenciación de Sanger (Figuras complementarias 4d, 5c). Posteriormente se seleccionaron un clon de CPC que albergaba una inserción homocigótica de 1 pb en PAPPA y un clon que albergaba una deleción de 8 pb en NID1 para el aislamiento de EV empobrecidos en PAPP-A (PAPPA KO) y empobrecidos en NID1 (NID KO) y se utilizaron. para estudios funcionales adicionales (Fig. 6c, Fig. complementaria 5d). Una línea CPC policlonal transducida con la maquinaria CRISPR/Cas9 y un ARNg no dirigido (NTgRNA) sirvieron como control CPC-EV normal. El agotamiento de PAPP-A en PAPPA KO-EV aislados se confirmó mediante transferencia Western (Fig. 6d). El agotamiento de PAPP-A resultó en una reducción del crecimiento celular pero no influyó en la morfología celular (Figuras complementarias 4e, f) y la producción de EV determinada mediante transferencia Western identificó niveles similares de CD81, Syntenin-1, Flotillin y β-actina tanto en PAPPA. KO- y NTgRNA-EV (Fig. 6d). La expresión de CD63 parecía ligeramente reducida en los PAPPA KO-EV. Ambas poblaciones de EV eran similares en tamaño, según lo determinado por NTA (Fig. 6e), y en pureza (μg de proteína/1 × 1010 EV) (Fig. 6f). Aunque las KO-CPC de NID1 también tuvieron una tasa de crecimiento ligeramente más lenta en comparación con las CPC de NTgRNA (Fig. 5e complementaria) y mostraron una morfología ligeramente más alargada (Fig. 5f complementaria), la liberación de EV no se vio afectada según lo determinado por NTA y por la expresión. de los marcadores EV CD81, Syntenin-1 y niveles de β-actina (Figura complementaria 5g, h). Los NID1 KO-EV contenían una cantidad de proteína ligeramente mayor por partícula (μg de proteína / 1 × 1010 EV) (Figura complementaria 5i).

A continuación, evaluamos la influencia de PAPP-A y NID1 KO en la angiogénesis inducida por EV. En comparación con los NTgRNA-EV, los PAPPA KO-EV fueron menos bioactivos para inducir la fosforilación de AKT en HMEC-1, cuando la adición de EV se normalizó en el número total de partículas o en el contenido total de proteínas (Fig. 7a – d, Fig. complementaria 9i – k). . Además, se observó una tendencia hacia una reducción de la fosforilación de ERK1/2. NID1 KO no afectó la actividad estimulante de EV (Figuras complementarias 6a-d). En un ensayo de raspado HMEC-1, los PAPPA KO-EV también fueron menos potentes para inducir el cierre de la herida, calculado tanto como porcentaje de cierre de la herida como distancia de migración absoluta, cuando se normalizó para el número total de partículas o el contenido total de proteínas (Fig. 7e). Además, los PAPPA KO-EV perdieron parte de su capacidad para inducir la formación de brotes en un ensayo de brotación in vitro (Fig. 7f, g). Por el contrario, no hubo diferencias en la actividad entre NID1 KO- y NTgRNA-EV para inducir el cierre de heridas (Figura complementaria 6e). Se ha planteado la hipótesis de que NID1 participa en la reparación cardíaca uniéndose al receptor de integrina αVβ y activando así la señalización MAPK aguas abajo27. Sin embargo, la fosforilación de AKT y ERK1/2 inducida por EV y el cierre de la herida no se vieron influenciados por el tratamiento previo de un anticuerpo IntegrinαVβ3 (Figuras complementarias 7a-d). Además, el NID1 recombinante no indujo la fosforilación de AKT y ERK1/2 ni fue capaz de inducir el cierre de heridas en el ensayo de raspado HMEC-1. Esto implica que NID1 asociado a EV no contribuye a la funcionalidad de CPC-EV en nuestros ensayos in vitro. En general, nuestros datos sugieren que PAPP-A está enriquecido en CPC-EV y participa en la activación de células endoteliales mediada por EV a través de la vía de señalización de IGF-R.

a – d Análisis de transferencia Western representativos de pAKT, tAKT, pERK1/2 y tERK1/2 en HMEC-1 tratados con PAPPA KO y NTgRNA-EV normalizados en dos dosis de a, b número total de partículas o c, d contenido total de proteínas . Se incluyó β-ACT como proteína de mantenimiento. b, d Cuantificación de los niveles de expresión de pAKT, tAKT, pERK1/2 y tERK1/2 mediante densitometría expresada como relaciones pAKT/AKT y pERK/ERK (n = 3). Las réplicas biológicas de (a, c) también se muestran en las figuras complementarias 9i – k. e Ensayo de cicatrización de heridas que muestra los efectos de 1 µg y 2 × 1010 NTgRNA- y PAPPA KO-EV en la migración de HMEC-1, analizados como % de cierre de la herida y distancia de migración absoluta (n = 3, réplicas técnicas. Los datos son representativos de tres biológicamente experimentos independientes). f, g Ensayo de brotación que muestra la formación de brotes de HMEC-1 inducida por NTgRNA y PAPPA KO-EV en cuentas, analizado como (g) longitud media por brote y longitud total de brote por cuenta (n = 3, réplicas técnicas. Los datos son representativos de dos experimentos biológicamente independientes). Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,033, **p < 0,0021, ***p < 0,0002.

La SEC es un método ampliamente adoptado para el aislamiento de vehículos eléctricos, pero no produce una población de vehículos eléctricos completamente pura, ya que también se puede aislar conjuntamente una pequeña fracción de proteínas solubles. Como se ha postulado una contribución potencial de estas proteínas coaisladas a la función EV, nos propusimos investigar la contribución de las proteínas coaisladas a la funcionalidad de las preparaciones de CPC-EV aisladas por SEC. De hecho, confirmamos el enriquecimiento de las proteínas de la ECM en vehículos eléctricos (Tabla complementaria 2) e intentamos analizar si estas proteínas estaban empaquetadas en vehículos eléctricos o aisladas conjuntamente en nuestras preparaciones. Con este fin, se empleó la centrifugación en gradiente de densidad OptiprepTM después de SEC para separar aún más los vehículos eléctricos de las proteínas coaisladas (Fig. 8a). El análisis de transferencia Western de las diferentes fracciones confirmó la presencia de marcadores EV CD81, Syntenin-1 y CD63 principalmente en las fracciones 2 a 4 (Fig. 8b). El número total de partículas en cada fracción se midió utilizando NTA y mostró la presencia de partículas en las fracciones 2 a 4, aunque también estaban presentes partículas en la fracción superior (F1) (Fig. 8b). Las fracciones 1 a 5 que contienen EV (Opti-EV) y las fracciones 7 y 8 que contienen proteínas coaisladas (Opti-protein), como lo muestra la tinción de plata (Figura complementaria 3a), se recogieron y concentraron utilizando 100 o 10 Filtros de centrifugado con corte de kDa. Los Opti-EV y SEC-EV mostraron una distribución de tamaño similar (Fig. 8c), mientras que los Opti-EV contenían menos contenido de proteína por partícula en comparación con los SEC-EV, lo que sugiere una mayor pureza como se esperaba (Fig. 8d). La transferencia Western demostró una mayor expresión relativa de CD81 y Syntenin-1, y la ausencia de Calnexin en Opti-EV en comparación con SEC-EV, lo que confirma nuevamente una mayor pureza (Fig. 8e). TEM confirmó la presencia de partículas encerradas en membranas en ambas preparaciones de EV (Fig. 8f). Como descubrimos que el iodixanol aumentaba la bioactividad de los vehículos eléctricos para inducir la fosforilación de AKT y ERK1/2 y el cierre de heridas (Figura complementaria 3b, c), las concentraciones de iodixanol en todas las muestras se mantuvieron constantes (2%) en todos los ensayos funcionales para excluir la acción directa. efecto funcional del iodixanol. En un ensayo de activación endotelial, los Opti-EV indujeron la fosforilación de AKT y ERK1/2, aunque en menor medida que los SEC-EV (Fig. 8g, h, Fig. complementaria 9e, f). La fracción de proteína Opti también demostró una capacidad estimulante de HMEC-1 limitada. En un ensayo de rayado de HMEC-1, tanto los Opti-EV como la fracción de Opti-proteína mostraron capacidades de estimulación de la migración reducidas en comparación con los SEC-EV (Fig. 8i). Para investigar la asociación de PAPP-A con CPC-EV, investigamos la expresión de PAPP-A en las diferentes fracciones después del aislamiento en gradiente de iodixanol. La transferencia Western demostró que PAPP-A estaba presente tanto en las fracciones 4 a 7 positivas como negativas de tetraspanina (Figura complementaria 8). En conjunto, estos resultados sugieren que tanto las proteínas asociadas como las coaisladas presentes en las preparaciones crudas de SEC-EV pueden contribuir a la activación de las células endoteliales.

a Descripción esquemática del protocolo de aislamiento de vehículos eléctricos para obtener Opti-EV puros. Los SEC-EV se cargaron en el fondo de un gradiente OptiprepTM discontinuo y se ultracentrifugaron durante 16 h. b Se analizó el número de partículas de las fracciones resultantes (F1-8) mediante NTA (panel superior) y la presencia de proteínas marcadoras de EV CD81, CD63 y Syntenin-1 (SYNT) mediante transferencia Western. Se analizaron volúmenes iguales de cada muestra. La concentración de yodixanol se midió en cada fracción (panel inferior). Las fracciones 1 a 5 se combinaron y concentraron (Opti-EV). c Gráfico NTA representativo que muestra la distribución de tamaño y la concentración de partículas de SEC y Opti-EV purificados. d Contenido de proteína por 1 × 1010 SEC- y Opti-EV de tres experimentos representativos. El análisis de transferencia Western muestra la presencia de CD81, SYNT, β-actina (β-ACT) en fracciones de Opti-EV y proteínas purificadas, en comparación con SEC-EV crudos. Calnexin (CNX) solo estaba presente en el lisado de CPC (CL). La transferencia β-ACT completa se muestra en la figura complementaria 10. f Imagen TEM representativa de SEC y Opti-EV. g, h Análisis de transferencia Western representativo de AKT fosforilada (pAKT), AKT total (tAKT), ERK1/2 fosforilada (pERK1/2) y ERK1/2 total (tERK1/2) en HMEC-1 tratado con SEC-EV y Opti -EV normalizados en el número total de partículas, y con SEC-EV, Opti-EV y fracción de Opti-proteína normalizados en el contenido total de proteínas. Se incluyó β-ACT como proteína de mantenimiento (I = transferencia de proteína fosforilada, II = transferencia de proteína total). h Cuantificación de los niveles de expresión de pAKT, tAKT, pERK1/2 y tERK1/2 mediante densitometría expresada como relaciones pAKT/AKT y pERK/ERK (n = 3). Las réplicas biológicas de (g) se muestran en la figura complementaria 9e, f. i Experimento de cicatrización de heridas que muestra los efectos de SEC y Opti-EV en la migración de HMEC-1 normalizados tanto en el número total de partículas como en el contenido total de proteínas, analizados como % de cierre de la herida y distancia de migración absoluta. La adición de la fracción de proteína Opti se normalizó en volumen (n = 3, réplicas técnicas. Los datos son representativos de tres experimentos biológicamente independientes). Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,033.

Se ha demostrado que la administración de CPC-EV mejora la función cardíaca al promover diferentes procesos celulares, incluida la angiogénesis, en varios modelos animales preclínicos1. En línea con estudios previos, confirmamos que los CPC-EV son inductores activos de la activación y funcionalidad de las células endoteliales5,6. A pesar de los prometedores resultados preclínicos de la terapia con EV para la regeneración de tejidos, su traducción a la clínica todavía se ve obstaculizada por la reproducibilidad in vivo debido a la heterogeneidad de los EV y la escasa comprensión de los mediadores funcionales en los EV10,11. Para hacer avanzar los CPC-EV como terapias, se requieren más conocimientos sobre la carga funcional de los VE y los mecanismos de activación celular mediada por los VE. En este trabajo, investigamos la composición proangiogénica de los CPC-EV.

Para aumentar la liberación de EV por parte de las CPC, exploramos el uso del ionóforo de calcio A23187, un compuesto descrito para estimular la liberación de EV mediante el aumento de los niveles de Ca2+ intracelular23,24,25,26. Curiosamente, la exposición de CPC al ionóforo de calcio no aumentó la liberación de EV, pero sí resultó en una población de EV menos funcional, como se muestra en diferentes ensayos de angiogénesis HMEC-1. Empleamos las diferencias en la funcionalidad entre CPC veh- y Ca ion-EV para investigar la activación específica de la señalización intracelular empleando análisis fosfoproteómico de HMEC-1 tras la estimulación con ambas poblaciones de EV. Este es uno de los primeros estudios que investiga la activación de la señalización intracelular en las células receptoras mediante fosfoproteómica tras la estimulación con EV, que podría identificar el aumento de la fosforilación de miembros de las vías de señalización P13K-AKT y (Insulina/IGF-) MAPK. Observamos cambios significativos en el nivel de fosfoproteoma pero no en el nivel de proteoma dentro de los 30 minutos posteriores a la estimulación con HMEC-1. Además, demostramos que la capacidad de los vehículos eléctricos para activar vías de señalización intracelular se perdió después de la eliminación de las proteínas de la superficie de los vehículos eléctricos mediante la proteinasa K, como se demostró anteriormente para los vehículos eléctricos derivados de otras fuentes30. Esto apunta a una rápida transducción de señales a través de interacciones receptor-ligando en lugar de la entrega de contenido de EV a través de la internalización de EV. De hecho, estudios recientes demuestran que los vehículos eléctricos contienen solo un número muy limitado de miARN específicos31,32,33,34,35, lo que corrobora la importancia de investigar la contribución de otros contenidos de vehículos eléctricos, como las proteínas, a la funcionalidad de los vehículos eléctricos.

Varios grupos han caracterizado previamente la composición proteómica de los vehículos eléctricos derivados de células madre y progenitoras, que actualmente está disponible a través de varias bases de datos36,37,38. Sin embargo, la identificación de componentes funcionales se realizó principalmente mediante comparaciones de vehículos eléctricos derivados de diferentes tipos de células7,39 o después de diferencias en el precondicionamiento celular40,41. Aquí, comparamos la composición proteómica de tipos de EV funcionalmente distintos, liberados del mismo tipo de célula y donante, eliminando así posibles diferencias en el contenido causadas por diferencias en la técnica de aislamiento y la variabilidad biológica del tipo de célula y el donante. El perfil de MS identificó una multitud de proteínas expresadas diferencialmente en veh-EV en relación con los iones de Ca-EV. Estas proteínas enriquecidas con veh-EV estaban sobrerrepresentadas en la "regulación de la migración celular" del proceso biológico de la ontología del gen PANTHER (top 3), lo que demostró nuestro enfoque como un método para la identificación imparcial de proteínas potencialmente involucradas en la migración celular inducida por EV.

El análisis proteómico de EM identificó las proteínas candidatas PAPP-A y NID1 enriquecidas en CPC-EV. Empleando CRISPR/Cas9, nos propusimos identificar su contribución a la función de los vehículos eléctricos. KO de NID1 no influyó en las capacidades de estimulación de HMEC-1 de los CPC-EV. Por el contrario, el agotamiento de PAPP-A de los CPC-EV produjo vehículos eléctricos con capacidad reducida para inducir angiogénesis in vitro. Barile et al.7 demostraron previamente la presencia de PAPP-A en los CPC-EV y su implicación en la cardioprotección. PAPP-A estaba presente en la superficie de los EV derivados de CPC y anuló la protección mediada por EV contra la muerte celular inducida por estaurosporina en las células HL-1. Como la pérdida de protección se provocó solo después de la adición del complejo IGF-1/IGFBP4, se sugiere que PAPP-A unida a EV escinda el complejo IGF-1/IGFBP4 y, por lo tanto, conduce a la liberación de IGF-1 y la posterior activación de las células diana28. Según los cambios medidos en el nivel de fosfoproteoma, pudimos identificar la vía Insulina/IGF-MAPK como la vía más enriquecida, proporcionando otro vínculo entre PAPP-A y la activación de la señalización de IGF-1-MAPK. Esto se ve respaldado aún más por nuestra observación de que el inhibidor de IGF-R PPP anuló la activación de HMEC-1 inducida por CPC-EV.

Se informó que los vehículos eléctricos liberados a partir de diferentes tipos de células madre tienen propiedades proregenerativas similares in vitro e in vivo42, pero también se han descubierto diferencias en la funcionalidad entre diferentes órganos y estados patológicos, como lo reflejan las diferencias en la carga funcional identificada de vehículos eléctricos9,10. Los vehículos eléctricos derivados de diferentes donantes de células (madre) podrían enriquecerse en diferentes cargas proteómicas funcionales, ya que la presencia tanto de PAPP-A como de NID1 en vehículos eléctricos se ha informado anteriormente38,43, pero no de manera reproducible44. Los perfiles proteómicos de diferentes vehículos eléctricos derivados de células madre podrían diferir en gran medida debido a la heterogeneidad de los vehículos eléctricos causada por los diferentes métodos utilizados para el aislamiento de vehículos eléctricos, como por ejemplo, es probable que la SEC elimine mejor las proteínas solubles excesivas en comparación con otras técnicas13, pero también por la variabilidad entre células Donantes y estado cultural2. Aquí, investigamos la contribución de proteínas individuales asociadas a CPC-EV para estimular procesos proangiogénicos in vitro, que claramente contribuyen, pero podrían no explicar, todas las propiedades pro-regenerativas de (CPC-)EV in vivo. Queda por investigar si PAPP-A contribuye a las propiedades regenerativas de los vehículos eléctricos en otros contextos.

Aunque los estudios iniciales identificaron los vehículos eléctricos como componentes funcionales del secretoma de las células madre, estudios más recientes han planteado la hipótesis de que también los factores coaislados solubles contribuyen a los efectos terapéuticos mediados por los vehículos eléctricos observados, que incluso podrían ser sinérgicos14,15,16,17,18. Estas observaciones sugieren que es probable que los estímulos terapéuticos liberados no estén mediados exclusivamente por vehículos eléctricos derivados de células madre. Observamos que muchas de las proteínas identificadas enriquecidas en veh-EV eran componentes conocidos de la ECM. Esto planteó la cuestión de si estas proteínas estaban realmente asociadas a los vehículos eléctricos o simplemente estaban presentes como resultado del coaislamiento. Aunque otros estudios han atribuido la función mediada por EV a miembros de la ECM al estar presentes en preparaciones de EV7,29,44, aún no se ha investigado la influencia de las proteínas coaisladas en preparaciones funcionales de CPC-EV, aisladas por SEC. Aquí, mostramos que a pesar del aislamiento SEC que separa los CPC-EV de las proteínas en función de las diferencias de tamaño, la preparación de EV todavía contiene proteínas coaisladas u otros factores que contribuyen a la función de los EV. De hecho, tanto los factores coaislados como los EV purificados adicionalmente tras la centrifugación en gradiente de densidad de iodixanol mostraron algunas propiedades proangiogénicas, como también lo demostraron otros45,46,47,48,49. Presumimos una contribución tanto de los factores asociados a EV como de las proteínas coaisladas a la función CPC-EV, que podría ser potencialmente sinérgica. Para obtener más información sobre la presencia de PAPP-A en nuestras preparaciones de CPC-EV, investigamos la presencia de PAPP-A en las diferentes fracciones después de la separación en gradiente de iodixanol. Observamos su presencia tanto en fracciones en las que también se detectaron tetraspaninas, como también en fracciones de mayor densidad, lo que implica que PAPP-A podría estar asociada a vehículos eléctricos con tetraspanina positiva, pero también con vehículos eléctricos con tetraspanina negativa. Alternativamente, los enlaces de glucosaminoglicano mediante los cuales se une PAPP-A a la membrana EV pueden alterarse durante la centrifugación de densidad en gradiente de iodixanol, lo que lleva a la eliminación de PAPP-A de la corona de proteína EV durante el proceso de aislamiento de EV. Sin embargo, se deben realizar más investigaciones para determinar la composición y contribución de una proteína corona a la función CPC-EV, incluida la presencia de proteínas candidatas específicas como PAPP-A.

En conclusión, demostramos que los CPC-EV pueden promover la activación de las células endoteliales y la migración celular e identificamos la composición proteómica de los CPC-EV funcionales que potencialmente contribuyen a estos procesos. Además, caracterizamos la señalización descendente tras la estimulación con CPC-EV en células endoteliales. Demostramos que tanto los factores asociados a EV como las proteínas coaisladas en la preparación de CPC-EV contribuyeron a la activación de las células endoteliales. Usando CRISPR/Cas9 para eliminar proteínas individuales de los vehículos eléctricos, identificamos que PAPP-A, pero no NID1, contribuye a la función de CPC-EV. Estos resultados respaldan la idea de que proteínas específicas presentes en las preparaciones de SEC-EV pueden inducir selectivamente señales específicas en las células receptoras para regular procesos como la angiogénesis. Este conocimiento de los componentes proangiogénicos y la localización de estos componentes en las preparaciones de CPC-EV se puede aplicar aún más en estudios futuros que exploren el uso de EV para aplicaciones terapéuticas.

Las células progenitoras cardíacas (CPC, donante HFH070809) se obtuvieron de corazones fetales humanos como se describió anteriormente50. El tejido cardíaco fetal humano se obtuvo mediante permiso individual mediante el consentimiento informado estándar por escrito y después de la aprobación del comité de ética del Centro Médico de la Universidad de Leiden, Países Bajos. Esto es de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki para el uso de sujetos o tejidos humanos. Las CPC primarias (pase 9-17) se cultivaron en medio SP++ (66 % de medio M199 (Gibco), 22 % de EGM-2 (Lonza), 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Life-Tech), 1 % de penicilina/estreptomicina. (P/S) (Invitrogen) y 1% de aminoácidos no esenciales MEM (Gibco) 12. Se cultivaron células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1, ATCC) en medio MCDB131 (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS, 1% de P/ S, L-glutamina al 5 % (Invitrogen), hidrocortisona 50 nM (Sigma) y rhEGF-1 10 ng/ml (Peprotech/Invitrogen) 51, 52. Las CPC y HMEC-1 se cultivaron en matraces recubiertos con gelatina al 0,1 %. Se cultivaron células de adenocarcinoma de ovario SKOV-3 (ATCC) y células HEK293fT en DMEM (Gibco) suplementado con 10% de FBS y 1% de P / S. Todas las células se cultivaron con 5% de CO2 a 37 °C y se sometieron a pases al 80-90%. confluencia después de la digestión con tripsina al 0,25%. Se preparó medio acondicionado con CPC-EV cultivando CPC durante 3 días en medio SP++ hasta alcanzar una confluencia del 80%, seguido de 24 h de cultivo en medio FBS basal y sin suplemento M199 que contenía 1 Ionóforo de calcio µM A23187 (Sigma) o vehículo (DMSO al 0,0125%). Para experimentos comparativos directos, se utilizaron líneas clonales de CPC (eliminadas) del mismo pasaje. El medio acondicionado con SKOV-EV se obtuvo cultivando SKOV-3 hasta un 80 % de confluencia, seguido de la sustitución del medio por DMEM sin ningún aditivo durante 24 h.

El medio acondicionado se recogió después de 24 h, se centrifugó a 2000 × g durante 15 minutos y se filtró 0,45 µm (filtro Nalgene con tapa de botella aPES de 0,45 µm) para eliminar los desechos celulares. El medio acondicionado se concentró usando filtros giratorios Amicon Ultra-15 de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDA (Merck Millipore) o mediante filtración de flujo tangencial (TFF) usando una cápsula Minimate TFF con MWCO de 100 kDa, y posteriormente se cargó en un Columna de alta preparación S400 (GE Healthcare) que utiliza un sistema de inicio ÄKTA (GE Healthcare) que contiene una celda de flujo UV de 280 nm. Las fracciones que contenían EV se agruparon, se filtraron utilizando un filtro de jeringa de membrana de acetato de celulosa (SCFA) sin tensioactivos de 0,45 µm (Corning) y se concentraron nuevamente utilizando un filtro giratorio MWCO Amicon Ultra-15 de 100 kDa (Merck Millipore). Los vehículos eléctricos se almacenaron a 4 °C durante un máximo de 2 días hasta su uso posterior.

Para obtener EV más puros, los SEC-EV se purificaron aún más empleando ultracentrifugación en gradiente de densidad de iodixanol. Se prepararon soluciones de 5%, 10%, 20 y 40% de iodixanol mezclando PBS con una solución acuosa de iodixanol OptiPrepTM al 60% (p/v). Se preparó un gradiente discontinuo colocando 3 ml de cada solución una encima de otra en un tubo de polialómero con la parte superior abierta de 14,5 ml (Beckman Coulter). Los vehículos eléctricos se cargaron en la solución al 40% en la parte inferior. Los tubos se centrifugaron a 100.000 x g y 4 ° C durante 16 h (rotor SW 32.1 Ti, Beckamn Coulter). De arriba a abajo se recogieron 8 fracciones de 1,5 mL cada una. Cada fracción se pesaba para determinar la densidad. La concentración de partículas se determinó mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Las fracciones que contenían EV (fracciones 1 a 5) se combinaron, se diluyeron con PBS y se concentraron utilizando filtros giratorios MWCO Amicon Ultra-15 o Ultra-4 de 100 kDa (Merck Millipore). Las fracciones que contenían proteínas (fracciones 7 y 8) se combinaron, se diluyeron con PBS y se concentraron usando filtros giratorios MWCO Amicon Ultra-15 de 10 kDa (Merck Millipore). El iodixanol restante se eliminó lavando con >20 ml de PBS y la eliminación completa se confirmó utilizando un refractómetro portátil eclipse brix óptico (Bellingham+Stanley).

Los vehículos eléctricos se incubaron en una concentración final de 100 µg/ml de proteinasa K (Promega) durante 30 minutos a 37 °C. La proteinasa K se inactivó diluyendo la muestra de EV a 1 ml en PBS suplementado con inhibidor de proteasa (Roche), y posteriormente se separaron los EV de las proteínas fraccionadas mediante SEC utilizando una columna Sepharose CL-4B conectada a un sistema de inicio ÄKTA (GE Healthcare) que contenía una celda de flujo UV de 280 nm. Se tomó en paralelo una muestra de EV sin tratamiento con proteinasa K, pero con las siguientes etapas de aislamiento y concentración, que sirvió como control sin tratar. Las fracciones que contenían EV se combinaron y se concentraron nuevamente usando un filtro giratorio MWCO Amicon Ultra-4 de 100 kDa (Merck Millipore).

NTA se realizó utilizando un sistema Nanosight NS500 (Malvern Technologies). Los vehículos eléctricos se diluyeron en PBS y se capturaron tres videos de 30 s usando un nivel de cámara de 15 y un umbral de detección de 5. El tamaño y la concentración de partículas se determinaron con el software Nanosight NTA 3.3 (Malvern Technologies). El potencial de la superficie de las partículas se midió mediante electroforesis láser Doppler en un Zetasizer Nano Z (Malvern Panalytical, Malvern, Reino Unido). Las muestras se diluyeron en DPBS 0,1X y la muestra se midió durante 20 series por triplicado.

Las concentraciones de proteína total de las muestras de EV se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce microBCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante después de la lisis en tampón RIPA 1x (Abcam). Las proteínas EV se analizaron con transferencia Western. Las muestras se mezclaron con tampón de muestra NuPAGE (Thermo Fisher Scientific) y agente reductor de muestras NuPAGE (Thermo Fisher Scientific) y se calentaron a 90 °C durante 10 minutos para reducir las proteínas. Se cargaron cantidades iguales de proteína en un gel de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12% (Thermo Fisher Scientific) y se sometieron a electroforesis. Las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) Immobilon-FL (Merck Millipore), que posteriormente se bloquearon con tampón de bloqueo Odyssey al 50 % v/v (LI-COR Biosciences) en solución salina tamponada con Tris (TBS). Los anticuerpos se incubaron en tampón de bloqueo Odyssey al 50 % v/v en TBS que contenía Tween 20 al 0,1 % v/v (TBS-T). Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-CD63 de ratón (Abcam, 1:1000), anti-CD9 de conejo (Abcam, 1:1000), anti-ALIX de ratón (Thermo Scientific, MA1-83977), anti-Calnexin de conejo (GeneTex, GTX 101676 , 1:1000), anti-β-actina de ratón (Sigma, 1:5000), anti-TSG101 de conejo (Abcam, 1:1000), anti-Syntenin-1 de ratón (Origene, TA504796, 1:1000), anti-β-actina de ratón (Origene, TA504796, 1:1000), -Anexina A1 (Abcam, ab214486, 1:1000), anti-Nidogen-1 de cabra (R&D Systems, AF2570), anti-PAPP-A de cabra (R&D Systems, AF2487), anti-PAPP-A de ratón (Hytest, 4PD4) y anti-CD81 de ratón (clon B-11, Santa Cruz, 1:1000). Los anticuerpos secundarios incluyeron anti-ratón de cabra conjugado con Alexa680 (Thermo Fisher Scientific, 1:7500) y anti-conejo de cabra conjugado con IRG800 (LI-COR Biosciences, 1:7500). Las imágenes se realizaron en un generador de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Biosciences) a 700 y 800 nm. Se detectó CD63 en muestras de proteínas no reducidas.

Se sembraron 140.000 HMEC-1 en una placa de 48 pocillos un día antes de la estimulación. 3 h antes de la estimulación, se privó de HMEC-1 utilizando medio MCDB131 basal. Se agregaron 6 × 1010, 2 × 1010, 3 µg o 1 µg de EV por duplicado durante 30 minutos para estimular HMEC-1. Se complementó PBS como control negativo. Para los experimentos de inhibición, se agregaron diferentes dosis (100–2000 nM) de picropodofilina (PPP; Calbiochem) 3 h, o se agregaron 10 µg/mL de anticuerpo anti-IntegrinαVβ3 de ratón (Novus Biologicals) 1 hora antes de la adición de EV al medio basal. Se incluyó como control positivo la estimulación con 200 ng/ml de IGF-1 recombinante (PromoCell) o 1 µg/ml de Nidogen-1 (R&D Systems). Para el análisis fosfoproteómico, se sembraron 260.000 HMEC-1 en una placa de 24 pocillos un día antes de la estimulación con 10 × 1010 EV o PBS. Las células se lisaron utilizando tampón de lisis sin EDTA cOmplete Lysis-M (Roche) suplementado con inhibidores de fosfatasa PhosSTOP (Roche) y se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Los sobrenadantes se utilizaron para experimentos adicionales de transferencia Western y análisis (fosfo)proteómico como se describe a continuación.

El contenido de proteína total de los lisados de HMEC-1 se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce microBCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y las proteínas se analizaron con transferencia Western. Las muestras se mezclaron con el agente reductor de muestras NuPAGE (Thermo Fisher Scientific) y el tampón de muestras NuPAGE (Thermo Fisher Scientific), se calentaron a 90 °C durante 10 minutos y se sometieron a electroforesis sobre geles de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12 % (Thermo Fisher Scientific). ). Las proteínas se transfirieron en membranas de PVDF Invitrolon (Thermo Fisher Scientific) utilizando el sistema de transferencia en seco iBlot 2 (Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, las membranas se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 5 % o con tampón de bloqueo Intercept al 50 % v/v (LI-COR Biosciences) en solución salina tamponada con Tris (TBS). Las incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios se realizaron en BSA al 0,5 % en TBS que contenía Tween 20 al 0,1 % (TBS-T) o en tampón de bloqueo Intercept al 50 % v/v en TBS-T. Los anticuerpos primarios incluyeron anti-fosfo-ERK de conejo (Phospho-p44/p42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204, Cell Signaling Technology, 1:1000), anti-ERK de conejo (p44/p42 (Erk1/2), Cell Signaling Technology, 1:1000), anti-fosfo-AKT de conejo (Ser473, Clone D9E, Cell Signaling Technology, 1:1000), anti-AKT de conejo (Cell Signaling Technology, 1:1000) y anti-β-actina de ratón ( Sigma, 1:5000). Los anticuerpos secundarios incluyeron anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP (DAKO) o anti-ratón de cabra conjugado con Alexa680 (Thermo Fisher Scientific, 1:7500) y anti-conejo de cabra conjugado con IRG800 (LI-COR Biosciences, 1:7500). Las proteínas se detectaron con sustrato de peroxidasa quimioluminiscente (Sigma) utilizando un sistema Chemi DocTM XRS+ (Bio-Rad) y el software Image LabTM, o las imágenes se realizaron en un generador de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Biosicences) a 700 nm y 800 nm.

Se hizo un rayado en una monocapa de HMEC-1 en una placa de 48 pocillos y se eliminaron las células flotantes. El medio se reemplazó por MCDB131 basal con o sin 2 × 1010 o 1 µg de EV o volúmenes iguales de PBS. Se incluyó como control positivo medio MCDB131 suplementado con 20% de FBS. Para los experimentos de inhibición, se agregaron 10 µg/ml de anticuerpo anti-IntegrinαVβ3 de ratón (Novus Biologicals) simultáneamente con la adición de EV. Se incluyó como control positivo la estimulación con 1 µg/ml de Nidogen-1 (R&D Systems). A las 0 y 6 h, se tomaron fotografías de campo brillante utilizando un microscopio EVOS (Life Technologies). El porcentaje de cierre y la distancia de migración absoluta se determinaron después de 6 h. El cierre relativo de la herida se calculó en relación con el control de PBS.

Se incubaron dos millones de HMEC-1 en suspensión con perlas de microportador Cytodex 3 (Cytiva) durante 4 h a 37 °C con agitación regular para permitir la unión celular a las perlas. Posteriormente, las perlas con células se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se preparó una mezcla de medio MCDB131 basal con tratamientos de 4 µg de EV o volúmenes iguales de PBS y factor de crecimiento reducido Matrigel (Corning, proporción 4:1:1) y se incrustaron ~50 perlas entre dos capas de la mezcla. en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de la solidificación de la mezcla de Matrigel, se agregaron 200 µl de medio MCDB131 basal encima y las placas se incubaron a 37 °C. Después de 72 h, se tomaron imágenes de campo brillante de 6 perlas por pocillo utilizando un microscopio EVOS (Life Technologies). Las imágenes se analizaron para determinar el número de brotes, la longitud media por brote y la longitud total por cuenta utilizando ImageJ con el complemento NeuronJ.

Se diseñaron ARN guía únicos (sgRNA) específicos para PAPP-A y NID1 humanos utilizando la herramienta de diseño CRISPOR (http://crispor.tefor.net/) y se analizaron el genoma del Homo Sapiens para minimizar los posibles efectos fuera del objetivo. Todas las secuencias de sgRNA y cebadores de PCR se enumeran en la Tabla complementaria 1. Los plásmidos que expresan sgRNA se lograron mediante la clonación del sgRNA en el vector LentiCRISPv2 (Addgene Plásmido número 52961) mediante oligo hibridación de oligo dúplex de sgRNA fosforilados en sitios Esp3I. Se formaron oligodúplex de sgRNA fosforilados ligando oligos de cadena superior e inferior (purificados por HPLC, IDT) con ligasa T4 PNK a 37 °C durante 30 min, seguido de una incubación de 5 min a 95 °C y una reducción gradual de 5 °C. por minuto a 25 °C. Para generar líneas CPC policlonales estables, las CPC se infectaron con lentivirus que expresan CRISPv2. Las células HEK293fT se sembraron en placas de 6 pocillos y se realizaron transfecciones de ADN plasmídico utilizando el reactivo Lipofectamine 3000 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante cuando las células tenían una confluencia del 50 al 60%. Se mezcló 1 µg de plásmido LentiCRISPv2 (Addgene #52961) con 1 µg de plásmido auxiliar pCMV delta R8.2 (Addgene#12263) y 0,5 µg de pCMV-VSV-G (Addgene #8454) y se complejaron en una proporción de 1 µg a 1 µl con Reactivo Lipofectamine 3000 y en proporción de 1 µg a 2 µl con reactivo P3000. Los complejos se agregaron a las células y se incubaron durante 48 h antes de recolectar el medio que contenía el virus. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 350 x g durante 15 minutos y filtración utilizando un filtro de jeringa SCFA de 0,45 µm (Corning). Las CPC se cultivaron en una placa de 24 pocillos hasta una confluencia del 50 % antes de la suplementación con 1 ml de medio que contenía virus que contenía 8 ng/ml de polibreno. Después de 24 h, el medio se cambió a medio SP++ y se generaron líneas celulares policlonales estables mediante selección con puromicina comenzando 48 h después de la transducción. Se obtuvieron clones knock-out (KO) individuales diluyendo en serie líneas KO policlonales en suspensiones de células individuales y expandiendo células individuales en una placa de 96 pocillos. Una vez confluente, el ADN genómico se extrajo utilizando el kit de purificación de ADN genómico GeneJet (Thermo Scientific) siguiendo el protocolo recomendado y se investigó en busca de una mutación bialélica homocigótica mediante la secuenciación de Sanger.

El ADN genómico se extrajo de CPC policlonales estables utilizando el kit de purificación de ADN genómico GeneJet (Thermo Scientific) siguiendo el protocolo recomendado. La región genómica que flanquea el sitio objetivo CRISPR/Cas9 se amplificó primero mediante PCR utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (NEB) en una plantilla de ADN de 100 ng. Después de una incubación inicial a 98 °C durante 30 s, se utilizaron 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s seguidos de una extensión final a 72 °C durante 10 min. . Posteriormente, los amplicones se sometieron a un proceso de fusión y reasociación en NEBuffer 2 (New England Biolabs) para permitir la formación de heterodúplex: 95 °C durante 5 min, 95 °C a 85 °C con rampa a 2 °C/s, 85 °C C a 25 °C a 0,1 °C/s. Después de la nueva hibridación, los productos se trataron con endonucleasa I T7 (New England Biolabs) durante 30 minutos a 37 °C siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y los productos de la digestión se separaron en gel de agarosa al 1 % que contenía bromuro de etidio. Se tomaron imágenes de los geles con un sistema de imágenes Gel Doc XR+ (Bio-Rad). Para confirmar el cambio de marco a nivel de ADN genómico en el sitio objetivo CRISPR/Cas9, se analizaron productos de PCR amplificados mediante secuenciación de Sanger.

Los triplicados biológicos de EV aislados se almacenaron a -80 ° C y la composición de proteínas se analizó mediante espectrometría de masas (MS). Para esto, los EV se lisaron con tampón de lisis SDS al 2 % (SDS al 2 %, HEPES 50 mM, pH 7,6, DTT 1 mM) y se prepararon para análisis de EM utilizando una versión modificada del protocolo de limpieza y digestión de la proteína SP353. Toda la proteína extraída de cada muestra se alquiló con cloroacetamida 4 mM. Se transfirió la mezcla de perlas Sera‐Mag SP3 (20 µl, Cytiva) a la muestra de proteína junto con acetonitrilo al 100 % hasta una concentración final del 70 %. La mezcla se incubó en rotación a temperatura ambiente (RT) durante 18 min. La mezcla se colocó en la rejilla magnética y se descartó el sobrenadante, seguido de dos lavados con etanol al 70% y uno con acetonitrilo al 100%. La mezcla de perlas y proteínas se reconstituyó en 100 µl de tampón LysC (urea 0,5 M, HEPES 50 mM, pH: 7,6 y proporción de enzima (LysC) a proteína 1:50) y se incubó durante la noche. Finalmente, se añadió tripsina en una proporción de enzima a proteína de 1:50 en 100 µl de HEPES 50 mM, pH 7,6 y se incubó durante la noche seguido de limpieza con péptido SP3. Brevemente, se agregaron a la muestra 20 µl de mezcla de perlas Sera‐Mag SP3 (10 µg/µl). A continuación se añadió acetonitrilo al 100% para conseguir una concentración final del 95%. Las muestras se mezclaron con pipeta y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se colocaron en una rejilla magnética. Se aspiró el sobrenadante, se descartó y las perlas se lavaron en 180 µl de acetonitrilo. Se retiraron las muestras del soporte magnético y se reconstituyeron las perlas en 20 µl de solución (acetonitrilo al 3%, ácido fórmico al 0,1%), seguido de 1 min de sonicación. Luego, las perlas se colocaron nuevamente en una rejilla magnética y el sobrenadante se recuperó y se transfirió a un vial de MS. Los péptidos se disolvieron en la fase móvil A de LC (3 % de acetonitrilo (ACN), 0,01 % de FA) y se inyectaron en el sistema de cromatografía líquida (LC)-MS/MS.

Los datos se adquirieron utilizando un sistema Dionex UltiMate ™ 3000 RSLCnano acoplado a un espectrómetro de masas Q-Exactive (Thermo Scientific). Las muestras se atraparon en una columna de desalinización con protección C18 (Acclaim PepMap 100, 75 µm × 2 cm, nanoViper, C18, 5 µm, 100 Å) y se separaron en una columna C18 de 50 cm de largo (Easy spray PepMap RSLC, C18, 2 µm). , 100 Å, 75 µm × 50 cm). El disolvente nanocapilar A era 95 % agua, 5 % DMSO, 0,1 % ácido fórmico; y el disolvente B era 5% agua, 5% DMSO, 95% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico. A un flujo constante de 0,25 µl/min, el gradiente curvo pasó de 6 % de B a 43 % de B en 180 min, seguido de un fuerte aumento a 100 % de B en 5 min.

El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo dependiente de los datos. Los péptidos se ionizaron en una fuente nESI a 1,9 kV y se enfocaron al 60% de amplitud de la lente de RF. Se adquirieron espectros MS1 de barrido completo de 400 a 1200 m/z en el Orbitrap a una resolución de 60 000 con el objetivo de AGC establecido en 1 × 106 o durante un tiempo de inyección máximo de 250 ms. Para cada ciclo, se aislaron los 10 iones precursores más abundantes (con una ventana de aislamiento de 2 m/z) para la fragmentación, mientras que los iones precursores con estados de carga 1 o no asignados se excluyeron para la fragmentación. La exclusión dinámica se estableció en una duración de 20 s. La fragmentación se realizó utilizando una energía de colisión normalizada HCD fija del 30%. Los iones de fragmentos se acumularon hasta alcanzar un valor objetivo de 2 × 105 iones o durante un tiempo máximo de inyección de 140 ms antes de la inyección en el Orbitrap para análisis MS2 con una resolución de 30.000.

El contenido de proteína total de los lisados de HMEC-1 estimulados se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas microBCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se combinaron dos réplicas biológicas para obtener 50 µg de proteína para el posterior análisis de enriquecimiento con fósforo. Las proteínas se precipitaron mediante el método de metanol/cloroformo: 1 volumen de muestra se mezcló secuencialmente con 4 volúmenes de metanol (Sigma-Aldrich), 1 volumen de cloroformo (Sigma-Aldrich) y 3 volúmenes de agua. La mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente y se eliminó la capa superior. Luego, se incorporaron 3 volúmenes de metanol y se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente, y se descartó la fase líquida mientras que el sedimento (proteínas) se dejó secar al aire. Los sedimentos de proteínas se reconstituyeron en 50 µl de tampón de digestión (Tris-HCl 100 mM, pH 8,5, SDC al 1 % (Sigma-Aldrich), TCEP 5 mM y CAA 30 mM) para reducir y alquilar las proteínas. Luego se realizó la digestión de proteínas agregando LysC en una proporción de 1:100 (p/p) durante 1 hora a 37 °C, seguido de una incubación durante la noche a 37 °C con tripsina en una proporción de 1:25 (p/p). Las digestiones se apagaron con FA al 0,5% y el precipitado de SDC se sedimentó mediante centrifugación a 20.000 x g durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se cargaron dos veces en puntas Stage Stage de lecho de 10 µL Pierce C18 (Thermo Fisher) para desalar, se lavaron con 100 µL de FA al 0,1% y los péptidos se eluyeron dos veces en ACN al 80%, FA al 0,1%, se secaron al vacío y se almacenaron a -80°. C antes del enriquecimiento con fosfopéptidos.

Los péptidos fosforilados se enriquecieron en cartuchos de Fe (III) -NTA de 5 μL (Agilent technologies) utilizando la plataforma AssayMAP Bravo (Agilent Technologies). Los cartuchos de Fe(III)-NTA se cebaron con 250 µL de TFA al 0,1 % en ACN a un caudal de 100 µL/min y se equilibraron con 250 µL de tampón de carga (80 % ACN/TFA al 0,1 %) a un flujo de 50 µL/min. tasa. Las muestras se disolvieron en 200 µL de tampón de carga y se cargaron en el cartucho a un caudal de 3 µL/min, seguido de un lavado de 250 µL en tampón de carga a 20 µL/min. El flujo de carga, que contiene el subconjunto no fosforilado del proteoma, se mantuvo para una mayor caracterización proteómica. Luego, los fosfopéptidos se eluyeron con 35 µl de amoníaco al 1 % a 5 µl/min directamente en 35 µl de ácido fórmico al 10 %. Las muestras se secaron al vacío y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis LC-MS/MS.

Los datos se adquirieron con un sistema Ultimate 3000 (Thermo Fischer Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fischer Scientific). Los péptidos se atraparon (Dr Maisch Reprosil C18, 3 µM, 2 cm × 100 µM) durante 5 minutos en disolvente A (0,1% de ácido fórmico en agua) antes de separarlos en una columna analítica (Agilent Poroshell, EC-C18, 2,7 µM, 50 cm × 75 µM). El disolvente B consistía en 0,1% de ácido fórmico en 80% de acetonitrilo. La captura de péptidos se realizó durante 2 minutos en B al 9% a un caudal de 300 nl/min. Para el análisis completo del proteoma, los péptidos se separaron en un gradiente de 13 a 44 % de B en 95 min, mientras que para el análisis fosfoproteómico, los péptidos se separaron en un gradiente de 9 a 36 % de B en 36 min. Después de la separación de (fosfo)péptidos, los gradientes se seguido de un fuerte aumento a 99 % B en 3 min, un lavado de 5 min en 99 % B y un reequilibrio de 10 min a 9 % B. El caudal se mantuvo a 300 nL/min. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo dependiente de los datos. Los péptidos se ionizaron en una fuente nESI a 1,9 kV y se enfocaron al 40% de amplitud de la lente de RF. Se adquirieron espectros MS1 de barrido completo de 375 a 1600 m/z en el Orbitrap con una resolución de 60 000 con el objetivo de AGC establecido en 1 × 106 y bajo cálculo automatizado del tiempo máximo de inyección. El tiempo de ciclo para los escaneos de fragmentación de MS2 se estableció en 1 s. Solo se fragmentaron los péptidos con estados cargados 2 a 6, y la exclusión dinámica se estableció en una duración de 10 ms para gradientes de 36 min y de 16 ms para gradientes de 95 min. La fragmentación se realizó utilizando una energía de colisión normalizada HCD fija del 28%. Los iones de fragmentos se acumularon hasta alcanzar un valor objetivo de 1 × 105 iones mediante un cálculo automatizado del tiempo máximo de inyección, con una ventana de aislamiento de 1,4 m/z antes de la inyección en el Orbitrap para análisis MS2 con una resolución de 30.000. Los datos sin procesar de proteómica se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio PRIDE54 y se puede acceder a ellos a través del identificador PXD030779.

Todos los datos sin procesar de (fosfo)proteómica se buscaron en MaxQuant (v_1.6.10.43)55 en la base de datos de proteomas de referencia humana SwissProt (que contiene 20,381 proteínas y se descargó de Uniprot en marzo de 2021). Los espectros se buscaron utilizando el motor de búsqueda Andromeda integrado de MaxQuant. Se estableció tripsina como enzima de digestión y se permitieron hasta dos escisiones omitidas. La carbamidometilación de cisteínas se estableció como una modificación fija, mientras que la acetilación N-terminal de proteínas y la oxidación de metionina se establecieron como modificaciones variables. Para el análisis de datos fosfoproteómicos, también se incluyó como modificaciones variables la fosforilación de serina, tirosina y treonina. La cuantificación sin etiquetas (LFQ) se habilitó utilizando una proporción mínima de dos y péptidos únicos y de afeitar para la cuantificación. Se habilitó la coincidencia entre ejecuciones, la ventana de tiempo de coincidencia siempre se estableció en 0,7 min, mientras que la ventana de tiempo de alineación se estableció en 20 min para el análisis proteómico y 10 min para el análisis fosfoproteómico. La tolerancia de los iones precursores se estableció en 20 ppm para la primera búsqueda y en 4,5 ppm después de la recalibración, y la tolerancia de los iones de fragmentos se estableció en 20 ppm. Se estableció una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1% a nivel de PSM, sitio y proteína mediante el uso de una estrategia de base de datos de señuelo inverso. Los datos se analizaron utilizando el software Perseus (v_1.6.14)56. En cada análisis, las proteínas cuantificadas (LFQ) en dos de cada tres réplicas se transformaron en log2 y los valores faltantes se reemplazaron individualmente para cada muestra de la distribución normal. Para el análisis fosfoproteómico, donde no fue posible equilibrar la inyección de MS basada en la intensidad, las intensidades de fosfosito se normalizaron a la intensidad acumulativa máxima (que se encuentra en la muestra veh-EV, réplica 2). Las diferencias estadísticas siempre se evaluaron mediante la prueba T de Student bilateral o ANOVA unidireccional y los valores p corregidos (valor q) se calcularon utilizando el método de permutación con hasta 250 iteraciones. Las proteínas se consideraron significativas cuando el valor q ≤ 0,05. El análisis de ontología genética se realizó utilizando PANTHER57 con el proteoma humano como conjunto de genes de fondo. Todos los gráficos se generaron utilizando paquetes R58.

Los vehículos eléctricos concentrados se adsorbieron en rejillas formvar recubiertas de carbono durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de un lavado con PBS, las rejillas se fijaron en glutaraldehído al 1% en tampón de fijación de PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de una contratinción con oxalato de uranilo. Las rejillas se incluyeron en una mezcla de 1,8 % de metilcelulosa y 0,4 % de acetato de uranilo a 4 °C y se tomaron imágenes en un microscopio TEM Jeol JEM-1011 (Jeol).

Los análisis estadísticos de los resultados del ensayo de rayado, del ensayo de brotación y de la densitometría de transferencia Western se realizaron utilizando Prism 5.0 (GraphPad Software Inc.). Para la mayoría de los experimentos, se realizaron tres réplicas biológicamente independientes y, por lo demás, se indica de forma diferente en la leyenda de la figura correspondiente. La diferencia estadística entre dos grupos se analizó mediante una prueba T de Student no apareada y para el análisis de densitometría de los resultados del WB, con corrección adicional de Welch. Las diferencias entre más de dos grupos se probaron con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple HSD de Tukey como prueba posterior. Las diferencias con valores de p bilaterales < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Todos los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos (fosfo)proteómicos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio PRIDE54, y se puede acceder a ellos a través del identificador PXD030779. Los datos de origen numéricos subyacentes a todos los gráficos y tablas se pueden encontrar en Datos complementarios 1.

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Los autores agradecen a las instalaciones de Proteomics Core del Science for Life Laboratory, al Karolinska Institutet por realizar el análisis LC-MS/MS del proteoma EV y a Cor Seinen por su excelente asistencia técnica con TEM. La Figura 6a fue diseñada usando BioRender (BioRender.com). Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC) bajo la subvención EVICARE (número 725229) a JS

These authors contributed equally: Julia Bauzá-Martinez, Simonides Immanuel van de Wakker.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Wei Wu, Pieter Vader, Joost Petrus Gerardus Sluijter.

Departamento de Cardiología Experimental, Centro Médico Universitario de Utrecht, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Marieke Theodora Roefs, Simonides Immanuel van de Wakker, Jiabin Qin, Willem Theodoor Olijve, Robin Tuinte, Marjolein Rozeboom, Christian Snijders Blok, Emma Alise Mol, Pieter Vader y Joost Petrus Gerardus Sluijter

Espectrometría de masas biomolecular y proteómica, Centro Bijvoet de Investigación Biomolecular e Instituto de Ciencias Farmacéuticas de Utrecht, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Julia Bauzá-Martinez & Wei Wu

Red de Inmunología de Singapur (SIGN), ASTAR (Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación), Singapur, Singapur

wei wu

CDL Research, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Peter Vader

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PV, JS, WW, MTR y JB idearon y planificaron los experimentos. MTR, JB, SW, JQ, WO, RT, MR, CSB y EM llevaron a cabo los experimentos. MTR escribió el manuscrito con el apoyo de JB, WW, PV y JS. Todos los autores discutieron los resultados y contribuyeron al manuscrito final.

Correspondencia a Wei Wu, Pieter Vader o Joost Petrus Gerardus Sluijter.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Milica Radisic y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Joao Valente.

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Reimpresiones y permisos

Roefs, MT, Bauzá-Martinez, J., van de Wakker, SI et al. Las vesículas extracelulares derivadas de células progenitoras cardíacas promueven la angiogénesis a través de proteínas tanto asociadas como coaisladas. Común Biol 6, 800 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05165-7

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Recibido: 16 de septiembre de 2022

Aceptado: 24 de julio de 2023

Publicado: 01 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05165-7

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