Imágenes

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12749 (2023) Citar este artículo

1 altmétrica

Detalles de métricas

La desregulación epigenética de la cromatina es una de las características del desarrollo y la progresión del cáncer, y se investiga continuamente como un posible biomarcador general de esta compleja enfermedad. Uno de los factores nucleares implicados en la regulación genética es la proteína DEK única, un acompañante de histonas que modula la topología de la cromatina. Los niveles de expresión de DEK aumentan significativamente desde células normales hasta células cancerosas, lo que plantea la posibilidad de utilizar DEK como marcador tumoral. Aunque se sabe que DEK está implicada en la regulación epigenética y transcripcional, los detalles de estas interacciones y su relevancia en el desarrollo del cáncer siguen siendo en gran medida difíciles de alcanzar. En este trabajo, investigamos la correlación espacial entre la distribución nuclear de DEK y los patrones de cromatina, junto con la progresión del cáncer de mama, aprovechando la espectroscopia de correlación cruzada de imágenes (ICCS) junto con el análisis del ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Realizamos nuestro estudio en el modelo basado en tres líneas celulares de mama humana bien establecidas para considerar la heterogeneidad de este tumor (células MCF10A, MCF7 y MDA-MB-231). Nuestros resultados muestran que la sobreexpresión de DEK se correlaciona con el mayor nivel general de proximidad espacial entre DEK y las marcas de histonas correspondientes a las regiones promotoras de genes (H3K9ac, H3K4me3), aunque no se correlaciona con la proximidad espacial entre DEK y los potenciadores de genes (H3K27ac). Además, observamos que las fracciones colocalizantes de DEK y las marcas de histonas son menores para el subtipo de células no invasivas que para la línea celular altamente invasiva (MDA-MB-231). Por lo tanto, este estudio sugiere que el papel de DEK en las regiones de cromatina transcripcionalmente activas varía según el subtipo de línea celular de cáncer de mama.

La condición fisiológica de la cromatina del ADN se mantiene en base a una compleja armada de procesos que funcionan en acción concertada para garantizar la regulación del ADN. Entre todos los mecanismos involucrados, la modificación de histonas representa una de las características distintivas1. Estas modificaciones (p. ej., acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación) a menudo se denominan “código epigenético”2, ya que influyen en la accesibilidad de la maquinaria de transcripción al ADN sin alterar directamente la secuencia del ADN. De hecho, el código epigenético desempeña un papel crucial en la orquestación de la mayoría de los procesos relacionados con el ADN. Los niveles no fisiológicos de modificaciones de histonas son comunes en diversas enfermedades humanas (p. ej., enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y cáncer3) y, como tales, a menudo están involucrados en el proceso de pronóstico4. Por ejemplo, en el contexto del cáncer de mama, el desequilibrio de la acetilación y la metilación de las colas de histonas da como resultado una apertura o cierre inusual de la estructura de la cromatina5, y varias otras marcas epigenéticas, por ejemplo, la ubiquitinación, están altamente desreguladas6,7,8,9. 10,11,12. En general, la alteración del patrón epigenético normal podría representar uno de los primeros pasos en el proceso de transformación oncogénica13.

Las modificaciones de las histonas regulan la expresión génica modulando la accesibilidad espacial al genoma de diversas proteínas que participan en los pasos del proceso de transcripción, a menudo denominada maquinaria de transcripción. Sin embargo, la modificación de histonas no es el único mecanismo que afecta a la regulación genética: de hecho, una variedad de proteínas desempeñan papeles importantes para este objetivo, participando en los distintos pasos del proceso de transcripción. Uno de los factores celulares implicados en la regulación génica es la proteína DEK, implicada también en varios mecanismos oncogénicos14,15. La sobreexpresión de la proteína DEK se asocia constantemente con una mayor proliferación celular, progresión tumoral, mal pronóstico de los pacientes y, en consecuencia, un estadio avanzado del cáncer. Además, este factor nuclear ubicuo se une a muchos genes altamente expresados16 y participa en la regulación genética de las células de cáncer de mama17. En este contexto, es de gran interés investigar más a fondo las interacciones de DEK con la estructura abierta de la cromatina. Para ello, elegimos la microscopía de fluorescencia confocal multicolor, una de las herramientas más potentes y versátiles para estudiar la codistribución espacial de proteínas nucleares. Para aumentar el contenido de la información recuperada por los datos de imágenes sin procesar, aprovechamos el análisis de espectroscopia de correlación cruzada de imágenes (ICCS) basado en píxeles, aplicado recientemente en un contexto similar18,19,20. Gracias al enfoque ICCS es posible caracterizar la colocalización de DEK con marcadores de cromatina, obteniendo así una medición indirecta de sus interacciones funcionales. Para poder validar estas posibles interacciones, suele ser beneficioso complementar el ensayo de colocalización de imágenes con técnicas in situ, por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) o co-inmunoprecipitación in vitro. En nuestro estudio, comparamos el análisis ICCS con el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), una solución prometedora para visualizar la proximidad a escala nanométrica entre dos factores etiquetados21,22. De hecho, este método aprovecha la inmunotinción indirecta y un ensayo posterior que involucra enzimas para revelar las interacciones de proteínas endógenas que se encuentran a menos de 40 nm de distancia23.

Aquí, aplicamos el enfoque ICCS y el análisis PLA para investigar la correlación espacial entre la distribución nuclear de la proteína DEK y el patrón de cromatina en el contexto de la progresión del cáncer de mama. Analizamos el paisaje de DEK en combinación con tres marcas de histonas prominentes, H3K4me3 y H3K9ac típicamente asociadas con promotores de genes transcripcionalmente activos, y H3K27ac que se encuentra en potenciadores de genes, para cuantificar sus distribuciones espaciales relativas. Realizamos nuestro estudio aprovechando un modelo bien establecido de progresión del cáncer de mama, es decir, tres líneas celulares que muestran heterogeneidad de este tumor: (i) línea celular epitelial de mama humana no tumorigénica MCF10A, ampliamente utilizada para estudiar la función y transformación normal de las células mamarias24 ,25; (ii) la línea celular MCF7, no invasiva y poco agresiva, que muestra un potencial metastásico bajo26 y que a menudo se utiliza para representar el subtipo luminal maduro que expresa tanto los receptores de estrógeno como de progesterona (ER+, PR+); y (iii) la línea celular invasiva metastásica de tipo basal, MDA-MB-231, que representa el tipo de cáncer de mama más difícil de tratar: el adenocarcinoma triple negativo (ER-, PR-, HER2-) propenso a la enfermedad epitelial-. a transición mesenquimatosa (EMT)27,28.

Primero, evaluamos la distribución nuclear de la proteína DEK entre las tres líneas celulares de cáncer de mama elegidas mediante microscopía confocal de fluorescencia (Fig. 1). Al igual que en otros estudios de microscopía15,29,30,31, observamos el patrón nuclear esperado de DEK en cada línea celular: la señal de fluorescencia parecía uniforme dentro del núcleo, reducida en intensidad en su periferia y ausente en los nucléolos. En las células MDA-MB-231, la mayor intensidad de fluorescencia, en comparación con las células MCF10A y MCF7, reveló la sobreexpresión de DEK, típica de etapas más avanzadas de la progresión del cáncer32.

Imágenes confocales de proteína DEK en líneas celulares modelo de cáncer de mama. Distribución nuclear de la proteína DEK en células MCF10A, MCF7 y MDA-MB-231 que representan estados de cáncer no malignos, metastásicos no invasivos y metastásicos altamente invasivos, respectivamente. La tabla de búsqueda (LUT) debajo de cada imagen indica el valor de gris mínimo y máximo de una imagen de 12 bits. Barras de escala = 5 μm.

Un número creciente de estudios implica una conexión entre las modificaciones postraduccionales alteradas de las proteínas y la progresión del cáncer de mama9,11,33,34. Por lo tanto, para un análisis más detallado, hemos elegido tres modificaciones de histonas postraduccionales cuyo nivel de aparición está asociado con el cáncer de mama: (i) H3K9ac, una marca de histonas de promotores de genes activos; (ii) H3K27ac, una marca bien establecida para potenciadores activos35 o superpotenciadores36,37; y (iii) H3K4me3, una marca de histona de promotores de genes activos. La literatura demuestra la asociación de los niveles de detección bajos/moderados de Western Blot para la modificación H3K9ac con un mal pronóstico10, incluso si esta marca de histonas a menudo se correlaciona con un gen particular implicado en la progresión del cáncer38. En cambio, se cree que la aparición de H3K27ac aumenta en los tejidos mamarios tumorales9. Además, para H3K4me3, se encontró que una alta intensidad de tinción inmunohistoquímica nuclear de H3K4me3 se correlacionaba con una menor supervivencia a 10 años y con una menor supervivencia específica del cáncer de mama8.

En nuestro modelo, investigamos la colocalización espacial de cada una de las modificaciones postraduccionales elegidas y la proteína DEK para arrojar nueva luz sobre sus posibles relaciones funcionales y, en general, sobre el papel de DEK en el desarrollo del cáncer de mama. Para ello, aprovechamos los enfoques basados ​​en imágenes y aprovechamos tanto el análisis de espectroscopia de correlación cruzada de imágenes (ICCS) como los métodos de ensayo de ligadura de proximidad (PLA). El ICCS se ha aplicado anteriormente para detectar interacciones dinámicas no solo basándose en imágenes confocales sino también en el contexto de microscopía de superresolución como SIM39 o SMLM20. En cambio, el PLA ofrece una amplia posibilidad de realizar pruebas cualitativas de la existencia de proximidad a nanoescala y posibles interacciones proteína-proteína en un diseño experimental basado en inmunidad22,40,41. Nuestro análisis ICCS de imágenes confocales de dos colores (Fig. 2A) reveló que la distribución relativa de DEK se correlacionaba con los sitios de eucromatina (Fig. 2B). En particular, observamos que la fracción colocalizada de DEK con cada una de las modificaciones H3 estudiadas fue significativa y consistentemente mayor para la línea celular metastásica invasiva MDA-MB-231 en comparación con las otras líneas celulares. La abundancia de DEK en estas marcas de cromatina activa puede sugerir la necesidad de reclutar DEK en los sitios de transcripción de genes en caso de fenotipo de cáncer de mama metastásico e invasivo. La prueba ANOVA unidireccional de los valores ICCS mostró diferencias significativas entre las tres líneas celulares con respecto a la colocalización de DEK con H3K9ac y H3K4me3 pero no con H3K27ac. Curiosamente, para H3K4me3 y H3K9ac, la fracción colocalizada con DEK es menor en las células MCF7 que en las células MCF10A. Este resultado puede explicarse considerando que los eventos específicos de acetilación o metilación de la histona H3 en diversos subtipos de cáncer de mama se regulan de manera diferente según el gen diana, como se demostró recientemente38. Para H3K27ac y DEK, la fracción de colocalización promedio en las células MDA-MB-231 (0,59 ± 0,09) fue significativamente mayor en comparación con la fracción de colocalización promedio en las células MCF10A (0,26 ± 0,06, p < 0,0167) y MCF7 (0,30 ± 0,08 p < 0,0167). Para la colocalización de H3K27ac y DEK, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre las células MCF10A y MCF7 (p = 0,18). Además, el perfil global de expresión genética de líneas celulares de tumores de mama muestra diferencias significativas entre los subtipos de cáncer en el nivel de genes expresados42. En particular, los estados de cromatina asociados al potenciador son los más variables entre las diferentes líneas celulares de cáncer de mama7.

Correlación entre la distribución de la proteína DEK y las regiones de cromatina activa en el modelo de cáncer de mama humano. (A) Imágenes confocales de líneas celulares modelo de cáncer de mama coinmunoteñidas con proteína DEK y modificaciones de histonas H3K4me3, H3K9ac o H3K27ac. Barras de escala = 5 μm. (B) Gráficos de barras de columnas que representan medias de fracciones colocalizadas extraídas del análisis ICCS. (C) Gráficos de diagrama de caja del análisis cuantitativo de manchas de PLA. Para (B) y (C), la significación estadística entre todos los grupos (p <0,0167, marcado con un símbolo de asterisco) se determinó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Bonferroni.

Los efectos biológicos de las proteínas sobre el estado celular están relacionados no sólo con sus diferentes niveles de expresión sino también con la interacción alterada con otros factores celulares. Por lo tanto, monitoreamos las posibles interacciones proteína-proteína entre DEK y las marcas de histonas de eucromatina enumeradas anteriormente. Para hacerlo, realizamos PLA, que reconoce la proximidad en el rango nanométrico (y, por lo tanto, las posibles interacciones) entre moléculas inmunoteñidas. En particular, analizamos los puntos detectados por PLA a partir de imágenes confocales de pila Z. La ubicación de los focos de PLA dentro del núcleo celular indica que se forman dentro de regiones de cromatina de menor densidad de ADN (Supl. Fig. 1). Después de realizar una prueba ANOVA unidireccional, observamos que había una diferencia estadísticamente significativa entre el número promedio de manchas de PLA en las tres líneas celulares estudiadas (Fig. 2C). Para DEK y H3K4me3, así como para DEK y H3K9ac, observamos un número aproximadamente dos veces mayor de manchas de PLA en las células MDA-MB-231 que en las células MCF10A y MCF7. En cambio, no hubo una diferencia significativa entre el promedio del número de manchas de PLA entre las células MCF10A y las células MCF7 (para H3K9ac y DEK, p = 0,485, para H3K4me3 y DEK, p = 0,498). Estos resultados, validados por un conjunto de controles positivos y negativos (Supl. Fig. 2), confirman y enriquecen nuestro análisis ICCS: en las células MDA-MB-231, la proteína DEK se localiza en las proximidades de H3K4me3 y H3K9ac, y parece interactuar con marcas de eucromatina más que en células MCF10A no malignas o MCF7 no invasivas. Curiosamente, el análisis de PLA muestra que, para las células MDA-MB-231, la proximidad molecular entre DEK y H3K9ac es significativamente mayor (40,5 ± 8,9) (Fig. 2C) en comparación con el MCF10A (19,9 ± 7,9, p <0,0167) y Células MCF7 (21,1 ± 5,9, p <0,0167). Esto sugiere la importancia particular de DEK en las secuencias genéticas marcadas por la acetilación de la histona H3 en la lisina 9. Sería de gran interés investigar más a fondo qué promotor de gen particular muestra este perfil epigenético y cómo podría regularse por la presencia de DEK. proteína en su proximidad.

En las células MDA-MB-231, se sabe que DEK está sobreexpresada32,43 y exhibe una mayor intensidad de fluorescencia en imágenes confocales que en las células MCF10A o MCF7. El análisis ICCS mostró que en las células MDA-MB-231, DEK se colocaliza con H3K27ac en un grado significativamente mayor que en otras dos líneas celulares. Sin embargo, el número de plazas de PLA no refleja esta tendencia. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre las células MCF7 y MDA-MB-231 (p = 0,645) con respecto al número promedio de manchas de PLA específicas para DEK y H3K27ac. Curiosamente, este número fue menor en las células MCF10A (10,1 ± 4,3) en comparación con las células MCF7 (17,3 ± 5,5, p <0,0167) y MDA-MB-231 (16,5 ± 6,6, p <0,0167). Aunque ambas proteínas en las células MDA-MB-231 se colocalizan espacialmente (fICCS = 0,59 ± 0,09), los últimos resultados pueden indicar que no permanecen en proximidad inferior a 40 nm, lo que sugiere que no interactúan. Gracias a la combinación de nuestros enfoques basados ​​en imágenes de microscopía, determinamos las interacciones y la proximidad espacial entre las proteínas en células intactas, lo que podría complementarse en el futuro con experimentos de inmunoprecipitación de cromatina. Sin embargo, según nuestro estudio, podemos plantear la hipótesis de que DEK está menos presente en los potenciadores (o superpotenciadores) de genes en este subtipo de cáncer de mama.

En este estudio, analizamos la correlación espacial entre DEK y las marcas de eucromatina en el modelo heterogéneo de cáncer de mama compuesto por líneas celulares MCF10A, MCF7 y MDA-MB-231. Se resaltaron y complementaron firmas de funciones de correlación cruzada específicas con el análisis PLA. Nuestros datos basados ​​en imágenes de microscopía muestran que la sobreexpresión de la proteína DEK se correlaciona con un mayor nivel de proximidad espacial entre DEK y H3K4me3 y entre DEK y H3K9ac, pero no se correlaciona con esta característica entre DEK y H3K27ac. Nuestra hipótesis es que esto podría estar relacionado con el posible aumento de la actividad de DEK en los promotores de genes. En conjunto, estos resultados enfatizan la conexión molecular entre la proteína DEK y la regulación de los sitios activos de la cromatina en el modelo de cáncer de mama. La novedad de este estudio radica en la evidencia de que DEK permanece preferentemente cerca de las regiones promotoras de genes en lugar de potenciadores de genes. En conclusión, los resultados de este estudio se relacionan con las numerosas funciones de la proteína DEK y, en general, allanan el camino para futuras investigaciones sobre los mecanismos epigenéticos de la cancerogénesis.

Se cultivaron células MCF10A epiteliales mamarias no transformadas (ATCC CRL-10317) en medio DMEM:F-12 (medio Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12) (1:1) (Gibco, 11330057) suplementado con 5% de caballo. Suero (HS), l-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina al 1% (Sigma-Aldrich, G6784), insulina 10 µg/ml (Sigma-Aldrich, I9278) y hidrocortisona 0,5 µg/ml (Sigma-Aldrich, H0888). Se añadió recién el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF, Sigma-Aldrich, E9644) antes de usar el medio completo (20 nm/ml). Se cultivaron células MCF7 y células MDA-MB-231 (ATTC HTB-26) en medio DMEM (Gibco, 11330057) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Euroclone, ECS0180L), penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma-Aldrich, G6784) y l-glutamina 2 mM. Las células se cultivaron en placas de Petri de 10 cm2 durante un mes (alrededor de 10 a 12 pases celulares) a 37 °C en CO2 al 5%. Para cualquier experimento con células fijadas, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con gelatina de cerdo al 0,5% (p/v) (Sigma-Aldrich, G2500) previamente disuelta en solución salina tampón fosfato (PBS) y se esterilizaron en autoclave.

Para la detección de la proteína de interés, los cultivos celulares se lavaron 3 veces con PBS precalentado y se fijaron con formaldehído (3,7%, sin metanol) durante 15 minutos. Después del bloqueo posterior con el tampón de bloqueo compuesto por 0,1% Triton X-100 y 3% p/v de albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 h a temperatura ambiente, las muestras se incubaron con el siguiente primario (durante la noche a 4 ° C) y anticuerpos secundarios (1 h a temperatura ambiente en la oscuridad): α-DEK (ratón, Santa Cruz, sc-136222, 1:50), α-H3K9ac (conejo, Invitrogen, 710293, 1:250), α -H3K4me3 (conejo, Abcam, Ab8580, 1:250), α-H3K27ac (conejo, Invitrogen, 720096, 1:500), α-PCNA (conejo, Sigma-Aldrich, HPA030522, 1:50), α-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11001, 1:250), α-conejo cabra Atto 532 (Rockland, 611-153-122, 1:200). Después de la incubación con anticuerpos secundarios, las células se enjuagaron 3 veces con PBS y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con yoduro TO-PRO™-3 (Invitrogen, 1:2000) cuando fue necesario, y se enjuagaron nuevamente 3 veces con PBS. Las muestras se montaron en ProLong™ Diamond Antifade Mountant (Invitrogen, P36961). El control positivo para el análisis ICCS se realizó en un par de dos marcas de replicación de ADN: focos de replicación teñidos con EdU Click-iT (con Alexa Fluor 594) y proteína de replicación PCNA.

Después de la fijación y permeabilización de las células, las muestras se procesaron para el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) según las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich) utilizando el reactivo de detección naranja in situ DuoLink® (DUO92102). Primero, la muestra se incubó durante 60 minutos a 37 °C en una cámara humidificada en una solución bloqueadora de PLA. Luego, las células se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos primarios en solución de anticuerpos: anticuerpo de ratón anti-DEK (Santa Cruz, sc-136222, 1:50) y α-H3K9ac (conejo, Invitrogen, 710293, 1:250). α-H3K4me3 (conejo, Abcam, Ab8580, 1:250), α-H3K27ac (conejo, Invitrogen, 720096, 1:500), α-H3K9me2 (ratón, Abcam, Ab1220, 1:200), α-H3K9me3 (conejo , Abcam, Ab8898, 1:500). Después del lavado posterior con el Tampón de Lavado A, realizamos el paso de Ligación durante 30 min a 37 °C y el paso de Amplificación durante 100 min a 37 °C en la oscuridad. Después del lavado con tampón de lavado B y PBS, las células se incubaron con el anticuerpo secundario anti-ratón Alexa Fluor 488 (ThermoFisher, A11001, 1:250), se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con yoduro TO-PRO™-3 (Invitrogen , 1:2000) cuando fue necesario, y se lavaron con PBS. Todas las muestras se montaron en ProLong™ Diamond Antifade Mountant.

Las mediciones se realizaron en un microscopio confocal de barrido láser Leica TCS SP5, utilizando un objetivo de inmersión en aceite HCX PL APO 100 × / 1,40–0,70 (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania). La excitación se proporcionó con un láser de luz blanca (SuperK, NKT) a la longitud de onda deseada para cada tinte: 488 nm (para Alexa Fluor 488), 532 nm (para Atto 532), 554 nm (para Quasar 570), 642 nm (para ToPro3), con bandas de detección de emisiones relevantes de 495 a 525 nm (para Alexa Fluor 488), 540 a 620 nm (para Atto 532), 560 a 625 nm (para Quasar 570) y 650 a 700 nm (para ToPro3). Las señales en diferentes canales se detectaron con fotomultiplicadores (PMT) o detectores híbridos (HyD). En la mayoría de los casos, se adquirieron imágenes de 512 × 512 píxeles con un tamaño de píxel de 40 nm.

Las imágenes de microscopía confocal se procesaron utilizando ImageJ (//imagej.nih.gov/ij/). El contraste de las imágenes se ajustó para mostrar señales de fluorescencia más débiles. El número de puntos de PLA se obtuvo utilizando un complemento 3D Object Counter a partir de imágenes confocales de pila Z.

Para el análisis de espectroscopía de correlación cruzada de imágenes 2D (ICCS), aplicamos el código MatLab de código abierto desarrollado por los autores del artículo original18 a series de imágenes de microscopía confocal. Brevemente, el análisis ICCS se refiere a la variante espacial de la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)44,45 y la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS)46. ICCS aplica el mismo formalismo al análisis de las fluctuaciones de intensidad espacial entre dos señales en la celda. El algoritmo ICCS recupera la fracción colocalizada (fICCS) a partir del ajuste de las funciones de correlación cruzada y automática de la imagen47,48. La fracción colocalizada recuperada por el ICCS es independiente de la densidad de los focos, lo que la hace ventajosa sobre los enfoques basados ​​en objetos, particularmente cuando se enfoca en focos de alta densidad18. Las funciones de correlación bidimensionales (2D) se calcularon como:

donde I1(x,y) e I2(x,y) son las imágenes en el primer y segundo canal, respectivamente, y los corchetes angulares indican el promedio de todos los píxeles seleccionados de la imagen. Las dos funciones de autocorrelación se obtuvieron configurando i = j = 1 e i = j = 2, respectivamente, mientras que la función de correlación cruzada se obtuvo configurando i = 1 y j = 2. Las funciones de correlación 2D luego se convirtieron en funciones radiales. -funciones de correlación dimensional Gij(δr) realizando una media angular, como se describió anteriormente49. Las funciones de correlación radial resultantes se ajustaron luego a un modelo gaussiano:

donde Gij(0) es el parámetro de amplitud, wij es un parámetro de ancho, Gij(∞) es un desplazamiento. Finalmente, la fracción de colocalización f se calculó como f = [G12(0)/G22(0) + G12(0)/G11(0)]/2.

Para probar si existen diferencias estadísticamente significativas en las medias entre líneas celulares (del número de manchas de PLA y valores promedio de ICCS), se realizó la prueba ANOVA unidireccional. Las diferencias de los valores de varianza se calcularon realizando la prueba F, seguida de las pruebas t de Student de dos muestras para cada conjunto de datos de pareja investigado, asumiendo la distribución de dos colas y la varianza homocedástica o heterocedástica en consecuencia. Para evitar el error tipo I de la prueba t, realizamos la corrección de Bonferroni para los valores de p50.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Espectroscopía de correlación cruzada de imágenes.

Transferencia de energía de resonancia de Förster

Ensayo de ligadura de proximidad

Análisis de variación

Espectroscopia de correlación de fluorescencia.

Espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia.

Bannister, AJ y Kouzarides, T. Regulación de la cromatina mediante modificaciones de histonas. Resolución celular. 21, 381–395 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Turner, BM Definición de un código epigenético. Nat. Biol celular. 9, 2–6 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fernandes, MT, Almeida-Lousada, H. & Castelo-Branco, P. Modificaciones de histonas en enfermedades. Modificación de histonas. El r. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-816422-8.00001-5 (2020).

Artículo de Google Scholar

Kurdistani, SK Modificaciones de histonas como marcadores de pronóstico del cáncer: una visión celular. Hno. J. Cáncer 97, 1–5 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zucchetti, B., Shimada, AK, Katz, A. y Curigliano, G. El papel de los inhibidores de la histona desacetilasa en el cáncer de mama metastásico. Mama 43, 130-134 (2019).

Artículo PubMed Google Scholar

Messier, TL y cols. La dinámica de acetilación y metilación de la histona H3 lisina 4 define los subtipos de cáncer de mama. Oncotarget 7, 5094–5109 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Xi, Y. et al. El perfil de modificación de histonas en líneas celulares de cáncer de mama resalta los puntos en común y las diferencias entre los subtipos. Genoma de BMC. 19, 1-11 (2018).

Artículo de Google Scholar

Berger, L. y col. Expresión de H3K4me3 y H3K9ac en cáncer de mama. J. Cáncer Res. Clínico. Oncol. 146, 2017-2027 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, QL y cols. La hiperactivación de potenciadores transcripcionales en el cáncer de mama. Clínico. Epigenética 11, 1-17 (2019).

Artículo de Google Scholar

Elsheikh, SE et al. Las modificaciones globales de las histonas en el cáncer de mama se correlacionan con los fenotipos tumorales, los factores pronósticos y el resultado del paciente. Res. Cáncer. 69, 3802–3809 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Karsli-Ceppioglu, S. et al. El panorama epigenético del análisis de todo el genoma promotor en el cáncer de mama. Ciencia. Representante 7, 1–8 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Jin, W., Li, QZ, Liu, Y. & Zuo, YC Efecto de las modificaciones clave de las histonas en la expresión de genes relacionados con el cáncer de mama. Genómica 112, 853–858 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jovanovic, J., Rønneberg, JA, Tost, J. y Kristensen, V. La epigenética del cáncer de mama. Mol. Oncol. 4, 242–254 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandén, C. & Gullberg, U. La oncoproteína DEK y sus funciones emergentes en la regulación genética. Leucemia 29, 1632-1636 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Ganz, M. y col. La oncoproteína DEK afecta el resultado de la inhibición de PARP1/2 durante un estrés de replicación leve. PLoS One 14, e0213130 ​​(2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandén, C. et al. La oncoproteína DEK se une a genes expresados ​​de forma elevada y ubicua con una doble función en su regulación transcripcional. Mol. Cáncer 13, 1–13 (2014).

Artículo de Google Scholar

de Albuquerque Oliveira, AC, Kappes, F., Martins, DBG y de Lima Filho, JL La oncoproteína DEK única en la salud de la mujer: un nuevo biomarcador potencial. Biomédica. Farmacóter. 106, 142-148 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Oneto, M. et al. Distribución a nanoescala de sitios nucleares mediante espectroscopia de correlación cruzada de imágenes superresueltas. Biofísica. J. 117, 2054–2065 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cainero, I. et al. Medición de distancias a nanoescala mediante microscopía de iluminación estructurada y espectroscopia de correlación cruzada de imágenes (SIM-ICCS). Sensores 21, 1–13 (2021).

Artículo de Google Scholar

Pelicci, S. y col. Nuevas herramientas para medir la colocalización de moléculas individuales en nanoscopia de fluorescencia mediante espectroscopia de correlación cruzada de imágenes. Nanomateriales 12, 686 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gustafsdottir, SM et al. Ensayos de ligadura de proximidad para análisis de proteínas sensibles y específicas. Anal. Bioquímica. 345, 2–9 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Weibrecht, I. et al. Ensayos de ligadura de proximidad: una incorporación reciente a la caja de herramientas de proteómica. Expert Rev. Proteomics 7(3), 401–409 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bagchi, S., Fredriksson, R. y Wallén-Mackenzie, A. Ensayo de ligadura de proximidad in situ (PLA). En Métodos de biología molecular vol. 1318 (ed. Hnasko, R.) 149–159 (Springer, 2015).

Google Académico

Qu, Y. et al. Evaluación de MCF10A como modelo confiable para células epiteliales mamarias humanas normales. PLoS One 10, 1-16 (2015).

Google Académico

Soulé, HD et al. Aislamiento y caracterización de una línea celular epitelial de mama humana inmortalizada espontáneamente, MCF-10. Res. Cáncer. 50, 6075–6086 (1990).

CAS PubMed Google Académico

Comşa, ŞC., Cîmpean, AMC & Raica, MR La historia de la línea celular de cáncer de mama MCF-7: 40 años de experiencia en investigación. Res. anticancerígena. 35, 3147–3154 (2015).

PubMed Google Académico

Prat, A. et al. Caracterización de líneas celulares derivadas de cánceres de mama y tejidos mamarios normales para el estudio de los subtipos moleculares intrínsecos. Res. del cáncer de mama. Tratar. 142, 237–255 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalluri, R. & Weinberg, RA Los conceptos básicos de la transición epitelial-mesénquimatosa. J.Clin. Investigando. 119, 1420-1428 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kappes, F., Burger, K., Baack, M., Fackelmayer, FO y Gruss, C. Localización subcelular de la proteína protooncogén humana DEK. J. Biol. Química. 276, 26317–26323 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hu, HG, Scholten, I., Gruss, C. y Knippers, R. La distribución de la proteína DEK en la cromatina de mamíferos. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 358, 1008–1014 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Takata, H. y col. Análisis de proteomas de fracciones insolubles nucleares humanas. Genes Cells 14, 975–990 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Privette Vinnedge, LM y cols. El oncogén DEK humano estimula la señalización, la invasión y la formación de mamosferas de Β-catenina en el cáncer de mama. Oncogén 30, 2741–2752 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suzuki, J. y col. Acetilación de proteínas y expresión de histona desacetilasa asociadas con la progresión del cáncer de mama maligno. Clínico. Res. Cáncer. 15, 3163–3171 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, W., Cui, Y., Ren, W. & Irudayaraj, J. Detección de biomarcadores epigenéticos mediante FLIM-FRET para terapia combinada en cáncer de mama ER+. Clínico. Epigenética 11, 1–9 (2019).

Artículo de Google Scholar

Creyghton, MP y cols. La histona H3K27ac separa los potenciadores activos de los potenciadores equilibrados y predice el estado de desarrollo. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 107, 21931–21936 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Raisner, R., Bainer, R., Haverty, PM, Benedetti, KL y Gascoigne, KE La adquisición de superpotenciadores impulsa la expresión de oncogenes en el cáncer de mama triple negativo. PLoS One 15, 1-19 (2020).

Google Académico

Pott, S. y Lieb, JD ¿Qué son los superpotenciadores? Nat. Gineta. 47, 8-12 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Judas, G. et al. Acetilación de H3K4, acetilación de H3K9 y metilación de H3K27 en subtipos moleculares de tumores de mama. Epigenómica 8, 909–924 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cainero, I. et al. Investigación de cromatina en el núcleo utilizando un enfoque fasorial para microscopía de iluminación estructurada. Biofísica. J. 120, 2566–2576 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Furia, L., Pelicci, PG y Faretta, M. Una plataforma computacional para microscopía de fluorescencia robotizada (II): daño del ADN, replicación, activación de puntos de control y progresión del ciclo celular mediante citometría de imagen multiparamétrica de alta resolución y alto contenido. Citomo. Parte A 83A, 344–355 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Söderberg, O. et al. Caracterización de proteínas y sus interacciones en células y tejidos mediante el ensayo de ligadura de proximidad in situ. Métodos 45, 227–232 (2008).

Artículo PubMed Google Scholar

Charafe-Jauffret, E. et al. El perfil de expresión genética de líneas celulares de mama identifica nuevos marcadores basales potenciales. Oncogén 25, 2273–2284 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yang, Y. et al. DEK promovió la EMT y la angiogénesis mediante la regulación de la vía PI3K/AKT/mTOR en el cáncer de mama triple negativo. Oncotarget 8, 98708–98722 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Di Bona, M. et al. Medición de la movilidad en la cromatina mediante FCS ordenado por intensidad. Biofísica. J. 116, 987–999 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Digman, MA y Gratton, E. Lecciones sobre espectroscopia de correlación de fluctuaciones. Año. Rev. Phys. Química. 62, 645–668 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Foo, YH, Naredi-Rainer, N., Lamb, DC, Ahmed, S. y Wohland, T. Factores que afectan la cuantificación de interacciones biomoleculares mediante espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia. Biofísica. J. 102, 1174-1183 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Comeau, JWD, Kolin, DL y Wiseman, PW Mediciones precisas de interacciones de proteínas en células mediante espectroscopia de correlación cruzada de imágenes espaciales mejorada. Mol. Biosistema. 4, 672–685 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, Y. et al. Determinación cuantitativa de correlaciones espaciales proteína-proteína en microscopía confocal de fluorescencia. Biofísica. J. 98, 493–504 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A. & Lanzanò, L. El análisis fasorial de ICS local detecta heterogeneidad en el tamaño y el número de vesículas intracelulares. Biofísica. J. 111, 619–629 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dunn, OJ Comparaciones múltiples entre medias. Mermelada. Estadística. Asociación. 56, 52 (1961).

Artículo MathSciNet MATEMÁTICAS Google Scholar

Descargar referencias

Los autores agradecen al Dr. Mario Faretta del Departamento de Oncología Experimental del Instituto Europeo de Oncología de Milán, Italia, por las células MCF10A, al Prof. Heiko Hermeking del Laboratorio de Patología Experimental y Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilians de Munich, Alemania, por los llamamientos del MCF7, y al Dr. Ferdinand Kappes del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Xi'an Jiaotong-Liverpool, Suzhou, China, por su apoyo y útil debate.

AP-M. recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie no. 841661 (qCHROMDEK). LL agradece el apoyo de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) en el marco del proyecto MFAG 2018 - ID 21931.

Isolda Cainero

Dirección actual: IRCCS Ospedale Policlinico San Martino, Largo Rosanna Benzi 10, 16132, Génova, Italia

Nanoscopia y NIC @ IIT, Instituto Italiano de Tecnología, Via Enrico Melen, 83, 16152, Génova, Italia

Agnieszka Pierzynska-Mach, Isotta Cainero, Michele Oneto, Luca Lanzanò y Alberto Diaspro

Departamento de Biología, Universidad de Konstanz, Konstanz, Alemania

Elisa Ferrando-May

Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania

Elisa Ferrando-May

Departamento de Física y Astronomía, Universidad de Catania, Catania, Italia

Luca Lanzano

DIFILAB, Departamento de Física, Universidad de Génova, Génova, Italia

Alberto Diaspro

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

AP-M., LL y AD concibieron la idea. AP-M. realizó el cultivo celular, preparó las muestras y realizó la obtención de imágenes y la adquisición de datos. MO participó en la preparación de las muestras y la discusión. AP-M., IC y LL implementaron el software y analizaron los datos. AD y LL supervisaron el proyecto. AP-M. escribió el artículo con contribuciones de todos los autores. AP-M., IC, MO, LL, EF-M., AD revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Alberto Diaspro.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pierzynska-Mach, A., Cainero, I., Oneto, M. et al. Un estudio basado en imágenes demuestra cómo la distribución a nanoescala de DEK se correlaciona diferencialmente con las marcas epigenéticas en un modelo de cáncer de mama. Informe científico 13, 12749 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38685-7

Descargar cita

Recibido: 11 de julio de 2022

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38685-7

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.