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Tecnología analítica de procesos en tiempo real para acelerar el desarrollo de productos biológicos y mejorar la consistencia de la fabricación

Por Colin Hebert, PhD, Mina Elahy, PhD, Sean Hart, PhD, Jonathan Turner, PhD y Renee Hart

El proceso general para desarrollar y fabricar vacunas y terapias celulares y genéticas (CGT) es desafiante y requiere muchos recursos porque involucra materias primas complejas y variables, procedimientos de bioprocesamiento exigentes y productos finales sensibles. La adopción de tecnologías analíticas sólidas para permitir el desarrollo rápido de procesos y garantizar la calidad y consistencia de la fabricación es un componente clave para evitar fallas en las solicitudes de licencias de productos biológicos.

Sin embargo, muchos métodos analíticos actuales, especialmente para vacunas y CGT, enfrentan desafíos en términos de velocidad, reproducibilidad y requisitos de recursos, lo que aumenta los costos y los tiempos de desarrollo. Los bioanálisis avanzados se están convirtiendo en una parte vital de un programa exitoso de biofabricación de calidad por diseño (QbD), donde datos exactos y precisos en tiempo real permiten mejorar la consistencia de la producción y la calidad del producto.

La implementación de tecnología analítica de procesos (PAT), donde los datos en tiempo real, incluidos los atributos críticos de calidad (CQA) y los parámetros críticos de proceso (CPP), pueden monitorearse y analizarse de manera integral y proactiva, permite controles de procesos avanzados y el desarrollo de procesos dinámicos y sólidos. procesos.

Laser Force Cytology™ (LFC™), una novedosa tecnología sin etiquetas, aplica fuerzas ópticas e hidrodinámicas a células individuales para medir sus propiedades biofísicas y bioquímicas intrínsecas sin el uso de colorantes, anticuerpos o etiquetas fluorescentes.1 Estas propiedades de fuerza óptica, incluido el índice de refracción, cambios con una amplia variedad de fenómenos biológicos, incluidas condiciones de salud celular, activación, transfección, diferenciación celular e infección viral.

LFC mide indicadores tempranos sutiles de cambios y diferencias fenotípicos de una manera sensible y rápida, lo que permite tanto análisis en proceso como ensayos de potencia y liberación fuera de línea para garantizar una calidad y rendimientos consistentes del producto.2-4 Por ejemplo, LFC puede proporcionar un coeficiente de variación tan baja como 14% cuando se mide la transducción de virus adenoasociados (AAV).

En este tutorial, aplicaciones LFC seleccionadas ilustran el beneficio de los datos de fuerza óptica en tiempo real para monitorear la diferenciación de células madre, la producción de AAV mediante transfección y la potencia de la vacuna de virus vivos. A diferencia de muchos ensayos que son laboriosos, lentos y poco confiables y, por lo tanto, no adecuados como métodos PAT, LFC proporciona resultados exactos, precisos y sensibles en minutos, lo que demuestra su papel clave dentro de los programas QbD.

Los anticuerpos tienen una amplia aplicabilidad como herramientas analíticas, incluida la caracterización de células fenotípicas, la detección/cuantificación de proteínas y la separación de proteínas. Sin embargo, los anticuerpos no están exentos de inconvenientes y, en muchos casos, un enfoque sin etiquetas es ventajoso. Al unirse a una célula, los anticuerpos pueden alterar su estado de activación. En consecuencia, la expresión de los marcadores de superficie no siempre es consistente y los resultados analíticos pueden verse afectados.

En cambio, un enfoque sin etiquetas permite medir la celda en su estado nativo. La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos pueden variar según el antígeno objetivo, la diversidad de la población y el lote de fabricación, lo que genera falsos positivos y falsos negativos, así como dificultades para repetir los resultados de los estudios basados ​​en anticuerpos.5 Los anticuerpos también requieren conocimiento previo y la disponibilidad de un marcador de superficie celular específico, evitando el descubrimiento a priori de cambios desconocidos o diferencias entre las células. Por el contrario, un enfoque sin etiquetas puede realizar mediciones imparciales y universales que no se ven afectadas por la variabilidad entre lotes.

Finalmente, los anticuerpos generalmente requieren mucho tiempo, costo y mano de obra para implementarse, lo que los hace intensivos en recursos y no modificables para su uso en métodos PAT. LFC proporciona análisis sin etiquetas con una mínima perturbación de la muestra y un rápido tiempo de obtención de resultados (minutos). Un ejemplo es el seguimiento de la diferenciación de las células madre. En la Figura 1 se muestran los datos de LFC que ilustran la diferenciación de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hBM-MSC) en osteoblastos o adipocitos.

Las hBM-MSC se midieron utilizando LFC antes de la diferenciación y luego se compararon con muestras recolectadas a los 7, 14 y 21 días después de la diferenciación para ambas vías utilizando el análisis de componentes principales (PCA).

Se utilizó PCA para refactorizar datos de toda la población a partir de múltiples parámetros de LFC en los componentes principales 1 y 2. En la Figura 1, se muestran los cambios para ambos linajes en comparación con las células indiferenciadas, y las muestras adipogénicas muestran resultados similares en los días 14 y 21, lo que indica que Es probable que la diferenciación se haya detenido, mientras que las muestras osteogénicas continúan progresando hasta el día 21.

Esto demuestra la capacidad de LFC para monitorear la diferenciación sin etiquetas, proporcionando resultados rápidos y sensibles para informar el desarrollo y la fabricación de procesos. La capacidad de obtener rápidamente resultados no subjetivos que rastrean la diferenciación permite el control del proceso en tiempo real más allá de la simple viabilidad y proliferación, sin la carga y el sesgo de las etiquetas basadas en anticuerpos.

La producción de vectores virales como lentivirus y AAV suele ser una parte integral del desarrollo y fabricación de terapias avanzadas, como terapias de células T con receptores de antígenos quiméricos y terapias génicas. Sin embargo, el uso de vectores virales enfrenta varios desafíos relacionados con su desarrollo y fabricación, desde la caracterización hasta la cuantificación y la purificación posterior.6,7

La fabricación, en particular, es un desafío cuando se trata de mantener consistentemente una alta pureza, potencia y seguridad y, al mismo tiempo, centrarse en controles de costos que sean aceptables para la fabricación a gran escala.8

Uno de los métodos de producción más comunes tanto para lentivirus como para vectores de AAV es el uso de transfección transitoria en células humanas (HEK293).9 Las herramientas actuales para monitorear y cuantificar CQA, como el título viral durante el proceso de transfección, requieren mucha mano de obra y son tediosas, lo que reduce la velocidad y eficiencia del desarrollo de procesos y la capacidad de monitorear en tiempo real.

En la Figura 2 se muestran los resultados de una colaboración entre Catalent Biologics y LumaCyte para comparar la producción de vectores de AAV usando tres reactivos de transfección diferentes, usando LFC y un ensayo de genoma viral basado en PCR de gotitas digitales (ddPCR).10 Los complejos de transfección se prepararon con ADN y con cada uno de los reactivos, y luego se agregaron a las células HEK293.

A las 72 h después de la transfección, las células se recolectaron y analizaron usando LFC y se compararon con células no transfectadas que crecían en paralelo. La Figura 2 muestra histogramas unicelulares para cada uno de los reactivos en comparación con el control. Para todos los reactivos, la transfección dio como resultado una ampliación de la distribución de velocidades, lo que indica una mayor heterogeneidad de la población. Además, el porcentaje de células de baja velocidad aumentó en las muestras transfectadas y, al definir un umbral de velocidad de 2.400 µm/s, fue posible comparar el rendimiento de los reactivos.

Como se muestra en la Figura 2, el reactivo 3 (TR#3) mostró la mayor respuesta, seguido por el reactivo 1 y el reactivo 2, respectivamente.

Cuando se utilizaron datos de velocidad, se generó una fuerte correlación entre las mediciones de LFC, que están disponibles casi en tiempo real, y los resultados de ddPCR, que requieren mucho tiempo y trabajo, lo que demuestra la gran utilidad de LFC para el monitoreo rápido de procesos para mejorar la velocidad de desarrollo y optimización de procesos y garantizar la consistencia de la fabricación.

Las aplicaciones adicionales de LFC en todo el proceso de producción de vectores de AAV incluyen el monitoreo de agentes adventicios para detectar rápidamente una posible contaminación, así como la caracterización de líneas celulares durante el desarrollo y ampliación del proceso.

La cuantificación y caracterización de los procesos de fabricación basados ​​en virus es un componente esencial de la producción de numerosas clases de productos, incluidas vacunas de vectores virales, virus oncolíticos y vacunas de virus vivos (LVV). En el caso de los LVV, la potencia o infectividad suele ser la medida de eficacia más crítica. Por lo tanto, la información de potencia en tiempo real procedente de una PAT es extremadamente deseable durante el desarrollo y la fabricación del proceso. Puede aumentar el conocimiento del proceso, mejorar los rendimientos y garantizar la coherencia.

Sin embargo, los métodos existentes para medir la potencia viral incluyen el ensayo de placa y el ensayo de dilución de punto final (dosis infecciosa del 50% en cultivo de tejidos, o TCID50), los cuales sufren de una alta variabilidad y largos tiempos de entrega. Por tanto, no son capaces de servir como PAT. Un estudio reciente realizado por McCracken et al.2 detalló el uso de LFC como plataforma PAT en tiempo real para medir la potencia del LVV y detectar la presencia de virus adventicios. En un aspecto del estudio, se sembraron células Vero en microportadores, se incubaron para permitir que las células se vuelvan confluentes y luego se infectan con el virus del sarampión atenuado. En cada momento posterior a la infección en múltiples experimentos independientes, se extrajo una muestra del biorreactor y se separó en dos fracciones.

El primero contenía los microportadores con células adheridas, mientras que el segundo contenía las células sobrenadantes que se habían desprendido de los microportadores. Se prepararon muestras celulares a partir de ambas fracciones y luego se analizaron utilizando LFC.

Paralelamente, se analizó la potencia viral de las muestras sobrenadantes mediante virometría de flujo como medida sustituta de TCID50. Aunque la virometría de flujo es una medida física más que un título infeccioso, se utilizó como una correlación aproximada con el ensayo de potencia basado en TCID50 para el virus del sarampión durante la producción.

Sin embargo, si la proporción entre partículas totales e infecciosas cambiara debido a alguna perturbación del proceso no detectada, una PAT basada en células como la LFC reflejaría este cambio, mientras que una medición física, como la virometría de flujo, no lo haría.

Como se muestra en la Figura 3, se desarrolló una fuerte correlación entre la potencia por célula viable y la métrica de infección Radiance, definida como el porcentaje de células con un índice de fuerza óptica superior a 55 s–1. Con esta correlación, la diferencia log10 promedio absoluta entre la potencia estimada y las mediciones de LFC es 0,074, lo que demuestra un ajuste excelente con los datos.

Una vez establecida, esta correlación se puede utilizar para calcular el título de futuras muestras de producción en minutos utilizando los datos de LFC.

El uso de LFC como PAT rápido para monitorear la potencia, así como un ensayo analítico para medir el título infeccioso, ayuda a allanar el camino para reducir los plazos de investigación, desarrollo y fabricación de las LVV, así como de otras vacunas que dependen de virus durante su proceso de desarrollo y fabricación. , incluidas vacunas de subunidades proteicas producidas en células Sf9 mediante vacunas de vectores virales basadas en baculovirus o adenovirus.

La capacidad de realizar mediciones rápidas y precisas de la infectividad basada en células tiene el potencial de mejorar todo el ciclo de vida del desarrollo de vacunas, desde la investigación y el desarrollo hasta los ensayos clínicos y la fabricación, reduciendo el costo y el tiempo asociados con las LVV y otras vacunas virales.

Referencias1. Hebert, CG, et al., Cuantificación rápida del virus de la estomatitis vesicular en células Vero utilizando Laser Force Cytology™. Vacuna, 2018. 36(41): pág. 6061-6069.2. McCracken, R., et al., Medición rápida en proceso de la potencia de la vacuna de virus vivos utilizando Laser Force Cytology™: allanando el camino para el desarrollo rápido de vacunas. Vacunas (Basilea), 2022. 10(10).3. Hebert, CG, et al., Ensayos de neutralización y cuantificación de la infectividad viral utilizando Laser Force Cytology™, en Tecnología de administración de vacunas: métodos y protocolos, BA Pfeifer y A. Hill, editores. 2021, Springer EE. UU.: Nueva York, NY. pag. 575-585.4. Bommareddy, PK, et al., La inhibición de MEK mejora la inmunoterapia con virus oncolíticos mediante una mayor destrucción de células tumorales y activación de células T. Sci Transl Med, 2018. 10(471).5. Baker, M., Crisis de reproducibilidad: la culpa es de los anticuerpos. Naturaleza, 2015. 521(7552): pág. 274-276,6. Clement, N. y JC Grieger, Fabricación de vectores virales adenoasociados recombinantes para ensayos clínicos. Métodos Mol Ther Clin Dev, 2016. 3: p. 16002.7. van der Loo, JC y JF Wright, Progresos y desafíos en la fabricación de vectores virales. Hum Mol Genet, 2016. 25(R1): pág. R42-R52.8. Wright, JF, Métodos de transfección transitoria para la producción clínica de vectores virales adenoasociados. Hum Gene Ther, 2009. 20(7): pág. 698-706.9. Matsushita, T., et al., Los vectores de virus adenoasociados se pueden producir eficientemente sin virus auxiliares. Gene Ther, 1998. 5(7): pág. 938-45.10. LumaCyte. Monitoreo sin etiquetas Radiance® de la transfección de AAV en células HEK293 mediante Laser Force Cytology ™ (LFCTM). 6 de junio de 2023]

Todos los autores trabajan en LumaCyte. Colin Hebert, PhD, es vicepresidente senior de operaciones científicas y comerciales. Mina Elahy, PhD, es científica senior de aplicaciones. Sean Hart, PhD, es director ejecutivo y director de operaciones; Jonathan Turner, PhD, es un científico de aplicaciones. Renee Hart es presidenta y CBO.